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文檔簡介
1、目的:通過體外實(shí)驗(yàn)研究電化學(xué)治療作用對宮頸癌細(xì)胞系離子通道的影響及其與細(xì)胞生長調(diào)亡之間的關(guān)系,進(jìn)一步探討電化學(xué)治療宮頸癌的作用機(jī)制。方法:采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長曲線以觀察在(5V,10C)的電化學(xué)治療劑量作用后,陰極、陽極以及(5V,10C)電化學(xué)治療作用后并添加了K離子通道開放劑的陰極、陽極細(xì)胞與未經(jīng)過治療的宮頸癌細(xì)胞生長趨勢的變化。噻唑蘭染色法(MTT)比較以上各組細(xì)胞的生長抑制率;全細(xì)胞膜片鉗模式測定經(jīng)(5V,10C)電化學(xué)治療后
2、陰極及陽極的細(xì)胞與未經(jīng)治療的宮頸癌細(xì)胞相比,其K離子通道電流的變化。RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)測定經(jīng)(5V,10C),(10V,10C),(10V,5C),(5V,5C)的電化學(xué)治療劑量的作用后,陰極及陽極細(xì)胞與未經(jīng)過治療的宮頸癌細(xì)胞相比較,其鉀離子通道蛋白基因KCNJ16,鈣離子通道蛋白基因CACNAlG,以及氯離子通道蛋白基因CLCN3mRNA的表達(dá)情況;半定量PCR(凝膠電泳成像分析法)測定并計(jì)算各電化學(xué)劑量陰極細(xì)胞及陽極細(xì)胞K
3、CNJl6,CACNAIG,CLCN3mRNA的相對表達(dá)值,并比較其差異。結(jié)果:(1)控制時(shí)間影響因素后,(5V,10C)電化學(xué)治療后陰極組及陽極組,(5V,10C)電化學(xué)治療后并添加K離子通道開放劑的陰極組及陽極組,與空白對照組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果之間比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),由生長曲線圖可知,空白對照組隨時(shí)間變化細(xì)胞數(shù)逐漸遞增;(5V,10C)治療后陰極及陽極組,細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化始終呈遞減趨勢,與其它三組區(qū)別明顯;(5V,10
4、C)電化學(xué)治療后并添加K離子通道開放劑的陰極組及陽極組細(xì)胞數(shù)先減少,第三天后逐漸增加,最后與正常對照組細(xì)胞生長趨勢一致。 (2)在宮頸癌HELA細(xì)胞中,利用全細(xì)胞膜片鉗模式記錄到持續(xù)激活的外向鉀電流。此類電流激活速度較快,失活速度很慢,具有外向整流特性,大約從0mV左右處開始出現(xiàn)可分辨的鉀電流,之后,隨著指令電壓的階躍攀升,通道開放逐漸增加,表現(xiàn)為外向電流值逐漸增大,故具有電壓依賴性。經(jīng)(5V,10C)電化學(xué)治療劑量作用后的陰極
5、及陽極與對照組細(xì)胞相比,細(xì)胞外向整流的鉀通道被明顯抑制,其中在鉗制電壓為10mv,20mv,30mv,40mv,50mv時(shí),各試驗(yàn)組與對照組相比,K離子通道電流強(qiáng)度均有下降,從Ⅰ-Ⅴ曲線可知,與對照組相比,經(jīng)電化學(xué)治療后,陰極及陽極組Ⅰ-Ⅴ曲線下移。(3)半定量PCR結(jié)果顯示:,對照組與經(jīng)電化學(xué)治療(5V,10C)陰極及陽極,(10V,10C)陽極KCNJl6相對表達(dá)值相比,治療后KCN/16表達(dá)下降,差別顯著(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)
6、意義;下降程度:(5V,10C)陽極>(10V,10C)陰極和陽極,差別顯著(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,后二者之間的差別無顯著差異(p>0.05),對照組與其余各組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對照組相比,經(jīng)(5V,lOC)電化學(xué)治療后,陰極處CACNAlG相對表達(dá)升高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P<0.05),余各組無顯著差異;(5C,10V)治療后陰極,(10C,10V)治療后陰極細(xì)胞組與對照組及其余各組細(xì)胞相比,CLCN3表達(dá)增高,差別有顯著
7、意義(P<0.05),其中此2組間的差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),前者該基因表達(dá)增高較后者顯著,余各組與對照組相比,該基因表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:(1)、細(xì)胞生長及抑制實(shí)驗(yàn)表明,(5V,10C)的電化學(xué)治療能使宮頸癌細(xì)胞的生長明顯受到抑制,而治療后加入鉀離子通道開放劑,能部分抵消了電化學(xué)對宮頸癌細(xì)胞的這種抑制作用。 (2)、全細(xì)胞膜片鉗記錄模式在宮頸癌HELA細(xì)胞中引出外向整流性鉀離子通道電流,該電流在接受了電化學(xué)治療后受
8、到抑制,抑制趨勢與電化學(xué)作用后細(xì)胞生長受限相附,因此認(rèn)為電化學(xué)治療可抑制外向整流性鉀離子通道,這種抑止作用為電化學(xué)治療抗腫瘤作用的機(jī)制之一。 (3)、電化學(xué)治療到達(dá)一定劑量強(qiáng)度下,可以引起KCNJ16、CNCL3、CACNAlG的改變,其中,KCNJ16為內(nèi)向整流性鉀通道的編碼基因,其改變主要發(fā)生在陰極,與電化學(xué)的治療機(jī)制相關(guān);CACNA1G和CNCL3分別為T型鈣通道的編碼基因和容量調(diào)控氯離子通道的編碼基因,在陰極處可有表達(dá)的
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