中草藥來源的三萜類及葡萄糖類化合物抑制HIV gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性篩選及確證.pdf

1、在HIV的感染過程中，首先是HIV包被膜與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生融合。HIV與靶細(xì)胞融合主要由包膜糖蛋白gp160(由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共價結(jié)合形成)介導(dǎo)。gp120與靶細(xì)胞上的CD4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)依次結(jié)合，導(dǎo)致gp41的構(gòu)型發(fā)生改變，形成六股α-螺旋束核心結(jié)構(gòu)，將病毒包膜與靶細(xì)胞膜拉近并發(fā)生融合，完成病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的感染過程。因此，抑制融合過程中的任何一個環(huán)節(jié)，就能抑制HI

2、V進(jìn)入靶細(xì)胞，從而預(yù)防和治療HIV的感染。gp120、gp41、CD4、趨化因子受體(CXCR4或CCR5等)均可作為HIV進(jìn)入抑制劑的藥物作用靶點。 目的：從馬尾樹科植物馬尾樹中提取三萜類化合物，從蛇菰科植物日本蛇菰中提取葡萄糖類化合物，篩選鑒定能有效抑制HIVgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的中草藥來源小分子化合物。 方法：用萃取和柱層析方法分離提純?nèi)祁惢衔锖推咸烟穷惢衔?，用酶?lián)免疫測定法(ELIsA)、天然聚丙烯酰胺

3、凝膠電泳(N—PAGE)、分子排阻高效液相色譜法(SE—HPLC)檢測其抑制HIVgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性，用細(xì)胞—細(xì)胞融合方法檢測化合物抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的活性。N36和C34是從HIVgp41的NHR和CHR區(qū)衍生出來的多肽，二者在體外能形成類似gp41NHR和CHR結(jié)合的螺旋結(jié)構(gòu)。因此，抗gp41六螺旋束核心結(jié)構(gòu)的活性可以用抑制N36和C34結(jié)合的作用來測定。 結(jié)果：我們從馬尾樹科植物馬尾樹的樹皮中提取三萜類化合物

4、，獲得五個單體成分即蠟果楊梅酸B(myricericacidB，R-3)、蠟果楊梅酸C(myricericacidC，DR-22B)、蠟果楊梅酸B甲酯(myricericacidBmethylester,R3-Me)、chilianthinA(R-1)、chilianthinD(DR-22A)。首先我們應(yīng)用基于抗原抗體反應(yīng)的ELISA法對這些化合物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)蠟果楊梅酸B(myricericacidB，R-3)、chilianthi

5、nD(DR-22A)、蠟果楊梅酸C(myricedcacidC，DR-22B)具有較好的抑制HIVgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成作用，IC50分別為7.22±0.25μg/ml、3.26±0.41μg/ml、4.01±0.54μg/ml，陽性對照化合物ADS-J1和90％TF的IC50分別為3.54±0.20μg/ml和5.00±0.12μg/ml。隨后我們應(yīng)用了兩種生物物理方法，即天然凝膠電泳(N—PAGE)和分子排阻高速液相色譜(SE—H

6、PLC)，對這三個三萜類化合物抑制六螺旋束結(jié)構(gòu)形成活性進(jìn)行進(jìn)一步的確證。N—PAGE法能根據(jù)多肽的分子量和荷電特性對其進(jìn)行分離，在加入三萜類化合物R-3、DR-22A、DR-22B后能夠明顯抑制gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)條帶的形成，表明這三個化合物能夠靶向HIVgp41并抑制六螺旋束結(jié)構(gòu)的形成，抑制強(qiáng)度與ELISA法的結(jié)果一致。應(yīng)用SE—HPLC法檢測三萜類化合物蠟果楊梅酸B(R-3)、chilianthinD、蠟果楊梅酸C(DR-22B)對

7、HIVgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的抑制作用可通過比較六螺旋束峰的峰面積來確定。在加入三萜類化合物R-3、DR-22A、DR-22B后能夠明顯降低六螺旋束峰的峰面積，且強(qiáng)度與前面的ELISA法和N—PAGE法相似。這充分說明了這三個三萜類化合物能夠作用于HIVgp41抑制其形成六螺旋束結(jié)構(gòu)，可能也在抑制HIV與靶細(xì)胞融合中發(fā)揮作用。 我們還從蛇菰科植物日本蛇菰地下和地上部分提取葡萄糖類單體化合物，分離得到1—O—咖啡酰基-β-D—吡

8、喃葡萄糖(1—O—caffeoyl-β-D—glucopyranose,BJ—821)、松柏苷(Coniferin,BJ—83)、1—O—香豆酰基-β-D—吡喃葡萄糖(1—O—coumaroyl-β-D—glucopyranose,BJ—842)、1,2-雙—O—咖啡酰基-β-D—吡喃葡萄糖(1，2-Di—O—caffcoyl-β-D—glucopyranose,BJ—86284)、1，2，6—三—O—咖啡酰基-β-D—吡哺葡萄糖(1，

9、2，6—Tri—O—caffcoyl-β-D—glucopyranose，BJ—862D)、1，3-雙—O—咖啡?；?β-D—吡喃葡萄糖(1，3-Di—O—caffcoyl-β-D—glucopyranose,BJ—851)、1，3-雙—O—咖啡?；?—O—沒食子酰-β-吡喃葡萄糖(1,3-Di—O—caffcoyl—4—O—galloyl-β-D—glucopyranose,BJ—8525)、1—O—咖啡?；?3-O—沒食子酰-β-

10、D—葡萄糖(1—O—caffcoyl-3-O—galloyl-β-D—glucose，BAT-17)、1,2，6—三—O—沒食子酰-β-D—吡喃葡萄糖(1，2，6—Tri—O—galloyl-β-D—glucopyranose,1,2，6—Tri)等9個單體化合物。同樣應(yīng)用了ELISA法、N—PAGE法及SE—HPLC法檢測了其抑制HWgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性。在ELISA法中，BJ—862D、BJ—8525、1,2，6—Tri對

11、HIVgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成具有較強(qiáng)的抑制作用，IC50分別為2.00±0.35μg/ml、0.83±0.16μg/ml、1.37±0.19μg/ml。進(jìn)一步用N—PAGE和SE—HPLC也驗證了其抑制六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的活性，且強(qiáng)度與ELISA法的相近。本研究還檢測了1，2，6—Tri抑制HIV包膜介導(dǎo)的細(xì)胞—細(xì)胞融合的活性，表明其可能抑制HIV與靶細(xì)胞的融合。 結(jié)論：通過對提取的三萜類和葡萄糖類化合物的篩選及其活性測定，我們