人Th17細(xì)胞的表型、功能特征及其與白色念珠菌感染的關(guān)系的研究.pdf

1、本論文的第一部分，我們運(yùn)用RT-PCR、ELISA、ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)全面系統(tǒng)地研究了正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中Th17細(xì)胞的表型及功能特征，主要研究PBMCs在不同的多克隆刺激劑刺激后產(chǎn)生IL-17的量，產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞亞群的頻率，IL-17與Th1/Th2型細(xì)胞因子的關(guān)系，Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的關(guān)系，Th17細(xì)胞的表型如記憶細(xì)胞標(biāo)志、活化標(biāo)志和趨化因子表達(dá)情況等。同時(shí)我們還對(duì)純化的CD4+T細(xì)胞中IL

2、-17 mRNA和IL-17的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，多克隆刺激劑anti-CD3加anti-CD28 mAb單克隆抗體(anti-CD3+anti-CD28 mAb)或PMA+Ionomycin刺激后，正常人PBMCs中IL-17mRNA的表達(dá)大大增強(qiáng)，并產(chǎn)生大量的IL-17，與刺激劑anti-CD3+anti-CD28 mAb相比，PMA+Ionomycin刺激產(chǎn)生的IL-17的量更大。同時(shí)，ELISPOT的結(jié)果顯示，在anti-

3、CD3+anti-CD28 mAb刺激后，106 PBMCs中平均有114個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生IL-17。產(chǎn)生IL-17的T細(xì)胞亞群分析顯示IL-17主要由CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生，其陽(yáng)性頻率在anti-CD3+anti-CD28 mAb和PMA+Ionomycin刺激后分別為0.53±0.29％和1.63±0.72％，表達(dá)IL-17的CD8+T細(xì)胞的頻率在兩種刺激劑刺激后均較低，分別為0.11±0.05％和0.11±0.07％。而且多克隆刺激劑在轉(zhuǎn)

4、錄及蛋白水平直接誘導(dǎo)純化的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生了大量的IL-17，從而證實(shí)了正常人PBMCs中存在一群對(duì)多克隆刺激劑應(yīng)答的Th17細(xì)胞。表型分析發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞表達(dá)CD45RO、CD69及趨化因子受體CCR6和CCR4，不表達(dá)CD45RA，部分表達(dá)CCR7，細(xì)胞呈現(xiàn)活化記憶細(xì)胞的表型，而且部分細(xì)胞為中央性記憶細(xì)胞。在對(duì)IL-17和Th1/Th2型細(xì)胞因子的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，anti-CD34+anti-CD28 mAb刺激后，大約有10％

5、產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ，30％產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-2，但I(xiàn)L-17幾乎不與Th2型細(xì)胞因子共表達(dá)。對(duì)比分析CD4+IL-17+T細(xì)胞和CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)中Foxp3和CTLA4的表達(dá)情況，結(jié)果表明，CD4+IL-17+T細(xì)胞和CD4+CD25high Treg細(xì)胞都高表達(dá)CTLA4，但只有CD4+CD25high Treg細(xì)胞表達(dá)Foxp3，說(shuō)明Th17細(xì)胞不同于T

6、reg細(xì)胞。 本論文的第二部分我們首先研究了正常人PBMCs中白色念珠菌特異性的Th17細(xì)胞。運(yùn)用RT-PCR、ELISA、ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段，我們主要研究了PBMCs在熱滅活的白色念珠菌的孢子或菌絲刺激后產(chǎn)生IL-17的量，產(chǎn)生IL-17的陽(yáng)性細(xì)胞頻率等。結(jié)果表明，白色念珠菌的孢子和菌絲刺激均可大大增加PBMCs中IL-17 mRNA的表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-17得到了類(lèi)似的結(jié)果。同樣，

7、ELISPOT的結(jié)果顯示，白色念珠菌的孢子或菌絲刺激后，106PBMCs中平均大約有18個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生IL-17。而且，流式細(xì)胞術(shù)分析表明，白色念珠菌的孢子或菌絲刺激PBMCs后，盡管陽(yáng)性頻率不高，但大多數(shù)正常人PBMCs中都能檢測(cè)到產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞，揭示正常人PBMCs中存在一群白色念珠菌特異性的Th17細(xì)胞。隨后，我們以正常人和白色念珠菌感染者為研究對(duì)象，對(duì)比分析了二者PBMCs在白色念珠菌刺激后產(chǎn)生IL-17的量，Th1

8、7細(xì)胞的頻率和抗原特異性Th17細(xì)胞的表型。結(jié)果顯示，白色念珠菌感染者的PBMCs在白色念珠菌刺激后產(chǎn)生更高的IL-17，抗原特異性的Th17細(xì)胞的頻率也高于正常對(duì)照，但二者的Th17細(xì)胞都呈現(xiàn)記憶細(xì)胞的表型。 綜上所述，我們的研究證實(shí)正常人PBMCs中存在一群記憶性Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞與Th1/Th2細(xì)胞及Treg細(xì)胞不同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)部分記憶性Th17細(xì)胞是白色念珠菌特異性的，白色念珠菌感染者的PBMCs在白色念珠菌刺激后