內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡機(jī)制及其體外調(diào)控在K562細(xì)胞中的初步研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，在維持機(jī)體平衡、疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其腫瘤的形成等方面發(fā)揮著重要作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)除死亡受體途徑和線粒體途徑外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡的重要新場所，并提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡途徑。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)或抑制在疾病治療領(lǐng)域呈現(xiàn)越來越重要的作用，尤其是腫瘤凋亡誘導(dǎo)治療。本課題以白血病敏感細(xì)胞株K562細(xì)胞和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞為研究對(duì)象，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶抑制劑

2、毒胡蘿卜素為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，探討了毒胡蘿卜素對(duì)白血病細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制和體外調(diào)控以及毒胡蘿卜素對(duì)K562/A02細(xì)胞化療敏感性的影響，期望為白血病治療提供一種新的靶點(diǎn)和策略。本文共分為四個(gè)部分。 第一部分毒胡蘿卜素對(duì)K562和K562/A02細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)研究 目的:探討毒胡蘿卜素對(duì)白血病敏感細(xì)胞株K562細(xì)胞和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 方法:采用Hoechst33258單染法

3、、丫啶橙/溴化乙錠雙染法觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)變化，透射電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率變化。 結(jié)果:白血病敏感細(xì)胞株K562和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，經(jīng)Hoechst33258單染法和丫啶橙/溴化乙錠雙染法染色，倒置熒光顯微鏡下觀察可見，K562和K562/A02細(xì)胞均呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)改變，即細(xì)胞體積變小、核固縮并向核膜靠攏，DN

4、A斷裂成斑快狀，而正常細(xì)胞呈彌漫性均勻熒光，呈正常結(jié)構(gòu)；透射電鏡觀察顯示：實(shí)驗(yàn)組K562和K562/A02細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的異染色質(zhì)發(fā)生固縮、邊集，核仁消失，胞漿中有空泡，原生質(zhì)著色不均勻，可見凋亡細(xì)胞表面出泡，最終脫落形成膜包被的凋亡小體，而對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)正常；AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測結(jié)果顯示毒胡蘿卜素誘導(dǎo)K562和K562/A02細(xì)胞發(fā)生典型的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率在一定范圍內(nèi)呈濃度和時(shí)間依賴性。

5、 結(jié)論:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素誘導(dǎo)白血病敏感細(xì)胞株K562和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡改變，并且細(xì)胞凋亡率在一定范圍內(nèi)呈濃度和時(shí)間依賴性。 第二部分毒胡蘿卜素誘導(dǎo)K562和K562/A02細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡的機(jī)制研究 目的:探討毒胡蘿卜素誘導(dǎo)白血病敏感細(xì)胞株K562和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡的可能機(jī)制。 方法:(略） 結(jié)果:細(xì)

6、胞內(nèi)[Ca2+]i檢測結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)下K562/A02細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i明顯高于K562細(xì)胞(P＜0.05)；與對(duì)照組比較，毒胡蘿卜素處理后的K562和K562/A02細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i均出現(xiàn)不同程度的升高(P＜0.05)，并在一定范圍內(nèi)具有明顯的濃度依賴性。Westernblot檢測結(jié)果顯示，毒胡蘿卜素處理后的K562和K562/A02細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達(dá)明顯增加，caspase-3，-7，-9，-12均出現(xiàn)不同

7、程度的剪切和活化，線粒體釋放細(xì)胞色素c明顯增加。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，毒胡蘿卜素處理后的K562和K562/A02細(xì)胞線粒體跨膜電位△ψm均出現(xiàn)不同程度的下降(P＜0.05)，并在一定范圍內(nèi)呈一定的濃度依賴性。 可見光分光光度計(jì)檢測表明，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)GSH濃度均出現(xiàn)不同程度的降低(P＜0.05)，并呈一定的濃度依賴性。 結(jié)論:毒胡蘿卜素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存鈣的釋放

8、和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡的發(fā)生；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)Caspase-12活化，活化的Caspase-12可能直接剪切活化Caspase-3，-7，-9，而Caspase-9的活化可能通過caspase-12活化和線粒體釋放細(xì)胞色素C形成凋亡體兩種途徑實(shí)現(xiàn)并直接活化Caspase-3，-7；Caspase-3，-7，-9，-12的剪切活化、線粒體跨膜電位△ψm的下降、線粒體細(xì)胞色素c的釋放增加以及細(xì)胞內(nèi)GSH濃度的降低可能是白血病細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)

9、網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡的重要機(jī)制之一；同時(shí)線粒體凋亡途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡途徑之間可能存在內(nèi)在聯(lián)系和凋亡信號(hào)放大環(huán)。 第三部分毒胡蘿卜素誘導(dǎo)K562和K562/A02細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡的體外調(diào)控研究 目的:初步探討毒胡蘿卜素誘導(dǎo)白血病敏感細(xì)胞株K562和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡的體外調(diào)控機(jī)制。 方法:RT-PCR檢測凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2、Bax、Bcl-XL、XIAP

10、和survivin以及MAGE-3基因mRNA表達(dá)水平的變化；免疫組織化學(xué)染色法檢測Bcl-2、Bax、Bcl-XL、XIAP、survivin和MAGE-3基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化。 結(jié)果:RT-PCR檢測結(jié)果顯示，毒胡蘿卜素處理后，K562細(xì)胞促凋亡基因BaxmRNA表達(dá)明顯上調(diào)，抑凋亡基因Bcl-2、survivinmRNA表達(dá)下調(diào)，但survivin表達(dá)下調(diào)更明顯，MAGE-3mRNA表達(dá)也是降低的，而抑凋亡基因Bcl-

11、XL、XIAPmRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/BaxmRNA表達(dá)相對(duì)量比值降低；K562/A02細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2和BaxmRNA表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2/BaxmRNA相對(duì)量比值降低，抑凋亡基因Bcl-XL、XIAP、survivinmRNA表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，但以XIAPmRNA表達(dá)下調(diào)最明顯，MAGE-3mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞Bcl-2家族成員Bax、Bcl-X

12、L蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)亦增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，凋亡抑制蛋白IAP家族成員survivin蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而XIAP蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，MAGE-3蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，Bcl-2/Bax蛋白質(zhì)比值下調(diào)；實(shí)驗(yàn)組K562/A02細(xì)胞與對(duì)照組比較，促凋亡成員Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，抑制凋亡成員Bcl-2蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)(P＜0.05)，B

13、cl-XL蛋白表達(dá)亦降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，凋亡抑制蛋白IAP家族成員survivin(P＜0.01)和XIAP(P＜0.05)蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，Bcl-2/Bax蛋白質(zhì)比值明顯降低，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別為0.8621和0.3228，MAGE-3蛋白表達(dá)亦明顯降低(P＜0.05)。 結(jié)論:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡過程中，K562細(xì)胞mRNA和蛋白質(zhì)水平上Bax表達(dá)明顯增加、Bcl-2/Bax比值下調(diào)、survivin表達(dá)

14、明顯降低和MAGE-3表達(dá)明顯下調(diào)可能發(fā)揮重要促凋亡作用，Bcl-XL和XIAP表達(dá)明顯上調(diào)可能發(fā)揮重要抑凋亡作用；K562/A02細(xì)胞Bax蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加、Bcl-2、survivin、XIAP和MAGE-3基因mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)明顯降低和Bcl-2/Bax比值下調(diào)可能發(fā)揮重要促凋亡作用。 第四部分毒胡蘿卜素對(duì)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)及其機(jī)制研究 目的:探討毒胡蘿卜素對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞

15、株K562/A02細(xì)胞化療敏感性的影響及其可能機(jī)制。 方法：（略） 結(jié)果:MTT法檢測結(jié)果顯示，毒胡蘿卜素對(duì)K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞均有劑量和時(shí)間依賴性的增殖抑制作用，并且K562/A02細(xì)胞較K562細(xì)胞對(duì)毒胡蘿卜素稍敏感，K562/A02細(xì)胞對(duì)ADM、DNR、VCR、VP-16、HHT和MXT呈現(xiàn)不同程度的交叉耐藥性，毒胡蘿卜素可不同程度地提高K562/A02細(xì)胞對(duì)ABM、DNR、VCR、VP-16、HHT

16、、MXT的化療敏感性或部分逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞的多藥耐藥性；流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示，毒胡蘿卜素具有抑制P-gp功能的作用，但對(duì)K562/A02細(xì)胞P-gp表達(dá)無影響；可見光分光光度計(jì)檢測結(jié)果顯示毒胡蘿卜素處理后的K562/A02細(xì)胞內(nèi)GSH濃度出現(xiàn)不同程度的降低；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明毒胡蘿卜素誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞Bcl-2、survivin、XIAP和MAGE-3蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)以及Bax蛋白表達(dá)明顯增加和

17、Bcl-2/Bax蛋白質(zhì)比值降低，而對(duì)Bcl-XL蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯影響。 結(jié)論:毒胡蘿卜素能提高K562/A02細(xì)胞的化療敏感性或部分逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞的多藥耐藥性；毒胡蘿卜素的凋亡誘導(dǎo)或細(xì)胞增殖抑制作用、對(duì)P-gp功能的抑制作用、促使細(xì)胞內(nèi)GSH濃度降低、誘導(dǎo)細(xì)胞Bcl-2、survivin、XIAP和MAGE-3蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)以及Bax蛋白表達(dá)明顯增加和Bcl-2/Bax蛋白質(zhì)比值降低可能是毒胡蘿卜素逆轉(zhuǎn)K562/