糖尿病大鼠骨代謝特點的研究觀察.pdf

1、目的：采用高糖高脂肪飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素和單次大劑量鏈脲佐菌素的方法，用雄性Wistar大鼠制備2型和1型糖尿病模型，以正常血糖大鼠和病程匹配的自發(fā)性2型糖尿病模型GK大鼠分別作為陰性和陽性對照，測定離體骨密度(BMD)、骨組織形態(tài)計量學(xué)和生物力學(xué)等指標(biāo)、骨轉(zhuǎn)換血清生化標(biāo)志物及調(diào)節(jié)骨代謝的細胞因子，觀察糖尿病狀態(tài)下大鼠骨代謝的特點；并與大鼠胰島素水平及代謝控制等因素進行相關(guān)分析，尋找導(dǎo)致其骨代謝紊亂的可能機制。 方法：實驗動

2、物分為四組：正常對照組(NC組)、2型糖尿病組(T2D組)、1型糖尿病組(T1D組)和自發(fā)性2型糖尿病模型GK大鼠(GK組)。T2D組大鼠在給予高脂飲食8周后，空腹?fàn)顟B(tài)下一次性腹腔注射小劑量STZ(30mg/kg)，1周后空腹?fàn)顟B(tài)下行腹腔葡萄糖耐量試驗，空腹血糖≥7.0mmol/L或2小時血糖≥11.1mmol/L確認為造模成功。T1D組大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下給予一次性腹腔注射大劑量STZ(60mg/kg)，72h后測隨機血糖≥16/7mmol

3、/L者，確定糖尿病模型建立。建模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)20周，同時納入病程相近的GK大鼠作為陽性對照。所有動物在處死前第14天開始進行四環(huán)素標(biāo)記。試驗結(jié)束時，留取24小時尿檢測尿Ca、肌酐和羥脯氨酸，計算羥脯氨酸(HOP)排出率；所有大鼠禁食12小時后測空腹體重，麻醉狀態(tài)下取血樣測定空腹血糖、胰島素、糖化血紅蛋白(GHb)、Ca、P、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6、胰島素樣生長因子(IGF)-1、骨鈣素(OCN)水平

4、和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性；留取腰椎、股骨、脛骨等骨標(biāo)本，測定第五腰椎及股骨BMD，做腰椎壓縮試驗及股骨三點彎曲試驗，取右側(cè)脛骨上端以甲基丙烯酸甲酯包埋，制作不脫鈣骨切片。應(yīng)用多媒體病理圖像分析軟件對VonKossa染色的5μm切片和未染色的7μm切片進行骨組織形態(tài)計量學(xué)分析。 結(jié)果：1、糖代謝狀態(tài)的檢測：T2D組空腹血糖、GHb、胰島素水平及HOMA-IR均明顯高于NC組(P＜0.01)，血清TG、TC和LDL水平也

5、明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。2、BMD和骨量的變化：T2D組、T1D組和GK組股骨、腰椎BMD和股骨灰干重比均明顯低于NC組(P＜0.05)；各指標(biāo)在糖尿病大鼠各組間無明顯差異(P＞0.05)。3、生物力學(xué)結(jié)果顯示：股骨三點彎曲實驗中T2D組、T1D組和GK組的最大載荷、能量吸收、最大應(yīng)變、截面慣性矩和彎曲剛性系數(shù)均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)；T1D組生物力學(xué)指標(biāo)較T2D組更顯著(P＜0.05)，而GK大鼠股骨生

6、物力學(xué)指標(biāo)無明顯差異。腰椎壓縮試驗中各組糖尿病大鼠的彈性模量和最大載荷均較對照組顯著降低(P＜0.01)；以TlD組的變化更明顯(P＜0.05或P＜0.01)，而GK大鼠各項生物力學(xué)指標(biāo)變化與T2D組大鼠相似(P＞0.05)。4、骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果：各組糖尿病大鼠骨體積顯著低于對照組(P＜0.01)，Tb.Th、OS/BS和O.Th均明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)；TlD組和GK大鼠的破骨細胞標(biāo)記ES/BS也有明顯下降(P＜0.0

7、5)。各組糖尿病大鼠骨組織動力學(xué)參數(shù)MS/BS、骨礦化沉積率和BFR均明顯降低(P＜0.01)，T1D組和T2D組的類骨質(zhì)成熟時間Omt明顯延長(P＜0.05)；但骨礦化延遲時間Mlt沒有明顯變化。糖尿病大鼠各組間沒有明顯差異(P＞0.05)。5、血尿骨代謝指標(biāo)的變化：各組大鼠血鈣、磷水平無明顯差異(P＞0.05)。與NC組相比，各組糖尿病大鼠血清24h尿鈣、TRAP活性和羥脯氨酸排除率HOP/Cr顯著升高(P＜0.01)，血清OCN水

8、平明顯降低(P＜0.01)；同時，血清IGF-1水平明顯下降(P＜0.01)，且T1D大鼠IGF-1水平明顯低于T2D大鼠(P＜0.01)。6、血清炎性細胞因子：各組糖尿病大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯高于對照組(P＜0.01)，糖尿病大鼠各組間無明顯差異(P＞0.05)。7、相關(guān)分析：GHb與骨密度、骨生物力學(xué)指標(biāo)及BV/TV均顯著負相關(guān)，IL-1β、IL-6和TNF-α與骨密度也顯著負相關(guān)(P＜0.05)。

9、 結(jié)論：1、高糖高脂飲食和小劑量STZ誘導(dǎo)的Wistar大鼠呈現(xiàn)明顯的高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗，并伴有血脂代謝紊亂，可用來成功制造2型糖尿病動物模型；2、該模型大鼠無明顯肥胖，可摒除肥胖對骨代謝的影響，可作為研究2型糖尿病骨代謝紊亂的理想動物模型。3、糖尿病狀態(tài)下大鼠表現(xiàn)為骨密度和骨量減少，骨力學(xué)強度降低；4、糖尿病狀態(tài)下大鼠不僅出現(xiàn)血、尿骨代謝標(biāo)記的異常，且可出現(xiàn)明顯的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，成骨細胞功能障礙可能是糖尿病骨代謝失

10、衡的主要機制，但破骨細胞也可能參與其中。5、糖尿病大鼠骨密度、骨生物力學(xué)和骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)與糖化血紅蛋白明顯負相關(guān)，提示高血糖及其糖基化終產(chǎn)物可能在糖尿病大鼠骨代謝紊亂中具有重要作用。 第二部分糖尿病大鼠骨組織RAGE、OPG、RANKL和IGF-1基因表達的研究 目的：采用單次注射大劑量鏈脲佐菌素的方法，用Wistar大鼠制備胰島素缺乏的糖尿病模型，免疫組化方法檢測骨組織中AGEs受體RAGE的表達，并用RT-PCR方法測

11、定骨組織RAGE、RANKL、OPG、IGF-1等基因表達，初步探討糖尿病狀態(tài)下高血糖和糖基化終產(chǎn)物對大鼠骨代謝相關(guān)基因表達的影響。 方法：雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC)、糖尿病組(T1D組)和糖尿病胰島素治療組(DI組)。T1D糖尿病的建模方法同前，成模后治療組給予胰島素0.6～1u/d以控制隨機血糖在10mmol/L以下，T1D組大鼠隔日皮下注射長效胰島素0.3～0.6u，以防止酮癥發(fā)生，但不明顯影響血糖水平

12、，隨機血糖在16mmol/l以上。糖尿病建模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)20周處死。試驗結(jié)束時，留取24小時尿檢測尿肌酐和羥脯氨酸，計算羥脯氨酸(HOP)排出率；麻醉狀態(tài)下取血樣測定空腹血糖、糖化血紅蛋白(GHb)、骨鈣素(OCN)水平和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性；留取股骨、脛骨等骨標(biāo)本，測定左側(cè)股骨BMD，用手術(shù)刀片刮除右側(cè)股骨骨膜后裝于凍存管中迅速投入液氮中，再轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。脛骨經(jīng)甲基丙烯酸甲酯包埋，制作不脫鈣骨切片。采用免疫組化

13、方法檢測脛骨組織RAGE蛋白表達，應(yīng)用多媒體病理圖像分析軟件測定RAGE陽性細胞積分光密度值。提取大鼠骨組織的總mRNA，利用實時熒光定量RT-PCR方法檢測大鼠股骨RAGE、RANKL、OPG和IGF-1基因表達。 結(jié)果：1、與NC組相比，T1D組骨組織RAGE免疫組化平均光密度值明顯升高(P＜0.01)。RT-PCR顯示T1D組大鼠股骨IGF-1mRNA表達明顯下降(P＜0.01)，RAGE、RANKL，mRNA水平顯著升高

14、(P＜0.01或P＜0.05)，OPGmRNA水平無明顯變化(P＞0.05)，而OPG/RANKL比值明顯低于對照組(P＜0.01)。胰島素治療可顯著改善上述糖尿病大鼠的變化(P＜0.01)。2、相關(guān)分析分析顯示，糖尿病大鼠RAGE蛋白免疫組化染色平均光密度值和mRNA水平與糖化血紅蛋白水平顯著正相關(guān)(r=0.656，P＜0.01：r=0.535，P＜0.05)；RAGEmRNA與股骨BMD和血清骨鈣素水平均顯著負相關(guān)(r=-0.583

15、，P＜0.01；r=-0.519，P＜0.05)，與血清TRAP和羥脯氨酸排泄率無明顯相關(guān)性。糖尿病大鼠骨組織RAGEmRNA與RANKLmRNA和RANKL/OPG比值均顯著正相關(guān)(r=0.555，P＜0.05；r=0.651，P＜0.01)；與IGF-1mRNA顯著負相關(guān)(r=-0.459，P＜0.05)；與OPGmRNA沒有顯著相關(guān)性。IGF-1mRNA與RANKLmRNA和RANKL/OPG比值均顯著負相關(guān)(r=-0.672，P

16、＜0.01；r=-0.567，P＜0.05)。 結(jié)論：1、高血糖狀態(tài)下累積的AGEs誘導(dǎo)其受體RAGEmRNA和蛋白表達上調(diào)；2、糖尿病大鼠骨組織RAGE表達增加，可能通過上調(diào)RANKL表達作用于偶聯(lián)骨重建的OPG/RANKL/RANK軸，使破骨細胞活性增加，而成骨細胞功能受抑，參與糖尿病大鼠骨丟失的發(fā)生。3、RAGE表達上調(diào)可能與骨組織局部IGF-1表達降低有關(guān)，后者可直接或間接通過對OPG/RANKL/RANK軸的作用而影響