木槿褪綠環(huán)斑病毒p27及其異形體的檢測(cè)和功能分析.pdf

1、木槿褪綠環(huán)斑病毒(Hibiscuschloroticringspotvirus，HCRSV)屬于香石竹斑駁病毒屬(Carmovirus)成員，除編碼5個(gè)屬保守性的可讀框(Openreadingframe，ORF)外，還編碼兩個(gè)特殊的ORFs(ORF6和ORF7)，前人的工作表明，通過(guò)體外翻譯，ORF6可以產(chǎn)生三個(gè)位于同一閱讀相、具有相同羧基端的異形體蛋白p27、p25和p22.5，稱(chēng)為p27及其異形體。本論文圍繞HCRSV編碼的p27及

2、其異形體，利用生物信息學(xué)、免疫學(xué)、反向遺傳學(xué)的方法和瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，證實(shí)了p27在HCRSV侵染過(guò)程中的表達(dá)，初步明確了p27及其異形體在病毒致病性中的作用。 由于p27的起始密碼子是非常規(guī)起始密碼子CUG以及p27及其異形體在carmoviruses編碼蛋白中的特殊性，本論文首先利用Kozak規(guī)則對(duì)編碼p27的核苷酸序列進(jìn)行分析，表明在基因序列組成上，p27是可以被表達(dá)的；然后利用生物信息學(xué)資源對(duì)p27的氨基酸序列、蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)

3、行分析，預(yù)測(cè)結(jié)果表明p27的羧基端具有一疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域，p27可以形成球形蛋白，具有可溶性，因此可以推測(cè)p27在生物體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。 為檢測(cè)p27及其異形體是否在HCRSV侵染的組織中表達(dá)，首先利用p27特異性抗體p19抗血清檢測(cè)來(lái)自HCRSV侵染的洋麻葉片的總蛋白，初步表明p27在HCRSV侵染過(guò)程中表達(dá)；由于p19抗血清反應(yīng)的背景值比較高，為明確p27確實(shí)是由CUG起始翻譯的，并同時(shí)檢測(cè)p25和p22.5，通過(guò)在p27的

4、起始密碼子下游和終止密碼子上游插入編碼FLAG標(biāo)簽的序列，利用FLAG單克隆抗體，在病毒侵染的洋麻原生質(zhì)體中檢測(cè)到p27的低量表達(dá)，沒(méi)有檢測(cè)到p25和p22.5的表達(dá)。當(dāng)將CUG突變?yōu)槌Ｒ?guī)起始密碼子AUG后，p27表達(dá)量急劇增加，表明p27的低量表達(dá)與非常規(guī)起始密碼子CUG起始有關(guān)。 以HCRSV侵染性克隆為材料，構(gòu)建p27及其異形體的起始密碼子和提前終止突變體，以阻止p27及其異形體的表達(dá)，將突變體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染洋麻原生質(zhì)

5、體并接種洋麻植株，研究p27及其異形體在病毒侵染和致病性中的功能。結(jié)果表明，p27及其異形體不參與病毒基因組和亞基因組的復(fù)制；p27參與調(diào)控病毒引起的系統(tǒng)癥狀的表現(xiàn)，缺失p27表達(dá)時(shí)，系統(tǒng)癥狀由褪綠環(huán)斑變?yōu)榛ㄈ~或輕微斑駁；p25促進(jìn)病毒的系統(tǒng)移動(dòng)，缺失p25表達(dá)時(shí)，病毒的系統(tǒng)移動(dòng)減緩，同時(shí)延遲了病毒引起的系統(tǒng)癥狀；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)p22.5在病毒致病性中的作用，推斷由體外翻譯結(jié)果得到的p22.5在病毒生命過(guò)程中可能不存在。同時(shí)缺失p27和p25

6、表達(dá)時(shí)，突變體不能在洋麻植株上引起癥狀，在接種葉檢測(cè)不到病毒的復(fù)制，但突變體可以在洋麻原生質(zhì)體中正常復(fù)制和表達(dá)CP，表明p27和p25共同調(diào)控病毒的胞間移動(dòng)和致病性。另外，當(dāng)增強(qiáng)p27表達(dá)時(shí)，病毒不能侵染洋麻植株，但可以在洋麻原生質(zhì)體中正常復(fù)制，只是檢測(cè)不到病毒編碼的外殼蛋白的表達(dá)，表明病毒在侵染過(guò)程中通過(guò)自身調(diào)控p27和CP的表達(dá)量來(lái)調(diào)控致病性。 將p27插入到表達(dá)載體pCam35S-GFP，使之融合到綠色熒光蛋白(green