柯薩奇病毒A6型結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原表位的定位和特征.pdf

1、手足口病(Hand，foot，and mouth disease HFMD)是一種兒童流行性傳染病，主要表現(xiàn)為手、足和口腔粘膜的皰疹。手足口病疫情近年在亞太地區(qū)呈上升趨勢(shì)，其病原為多種腸道病毒，包括腸道病毒71型，柯薩奇病毒A組（2，4，5，6，9，10，16型）、柯薩奇病毒B組（2，5型）以及?？刹《镜?。通常情況下，各種腸道病毒感染引起的HFMD在體征和臨床癥狀方面難以區(qū)別，但由于EV71感染引起的HFMD容易導(dǎo)致心肌炎、腦干腦炎、無

2、菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種嚴(yán)重并發(fā)癥，有較高的病死率及致殘率，所以早期特異性檢測(cè)和確診HFMD為何種腸道病毒感染對(duì)臨床治療有重要意義。
　　2012年8-12月，江西九江爆發(fā)手足口病，本實(shí)驗(yàn)室共收集到704份（每人一份）手足口病咽拭子標(biāo)本和200份病人血清，通過RT-PCR檢測(cè)咽拭子標(biāo)本，證實(shí)為柯薩奇病毒A6型(Coxsackievirus A6，CVA6)感染，確認(rèn)這次爆發(fā)為CVA6所致。2012年以后我國CVA6引起的

3、手足口病不斷增多，已逐漸成為引起手足口病爆發(fā)的主要病原之一。
　　CVA6為單股正鏈小RNA病毒科（Picornaviridae）、腸道病毒屬(Enterovirus)成員。與其他柯薩奇病毒一樣，CVA6病毒顆粒為二十面體立體對(duì)稱球形，無包膜和突起。其編碼的多聚蛋白經(jīng)自身蛋白酶水解為P1、P2和P3三種前體蛋白。P1區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1～4，組成病毒衣殼。以往研究認(rèn)為，VP1蛋白是小RNA病毒主要的中和決定因子，是特異性中和

4、表位的所在區(qū)域，直接決定病毒的抗原性。因此，VP1蛋白也是小RNA病毒疫苗和診斷試劑研制的主要對(duì)象。
　　本論文對(duì)CVA6主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1的表位鑒定以及抗原特性進(jìn)行研究，旨在為CVA6的疫苗研制和血清學(xué)診斷試劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果主要分為以下兩個(gè)部分:
　　一、CVA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1的大腸桿菌表達(dá)、單克隆抗體的制備及抗原特性分析
　　為了研究CVA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1的抗原特性，我們采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)C

5、VA6 VP1重組蛋白，蛋白純化后，以VP1重組蛋白作為抗原，通過間接ELISA法分析與抗CVA6血清的反應(yīng)性及與CVA16、EV71血清的交叉反應(yīng)性，評(píng)價(jià)其免疫反應(yīng)性。利用VP1重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備了一系列單克隆抗體。通過間接ELISA檢測(cè)單抗與CVA6、EV71和CVA16的VP1蛋白的免疫反應(yīng)性。結(jié)果如下:
　　A.利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了含CVA6 VP1全長(zhǎng)基因的pET28a重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌中能高效

6、表達(dá)CVA6 VP1重組蛋白，重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，根據(jù)表達(dá)蛋白所攜帶的蛋白標(biāo)簽，利用鎳離子金屬螯合親和層析技術(shù)獲得純化蛋白。
　　B.CVA6 VP1重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能與CVA6病毒免疫的小鼠血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)性，但與EV71、CVA16血清之間有顯著的交叉反應(yīng)。
　　C.利用CVA6 VP1重組蛋白免疫小鼠，制備了4株單克隆抗體，利用間接ELISA法分析顯示，4株單抗均可與CVA6 VP1蛋白反應(yīng)，

7、其中一株單抗(6C1)可同時(shí)與EV71VP1重組蛋白和CVA16 VP1反應(yīng)，兩株單抗(5A8，4A3)不與EV71 VP1反應(yīng)，但與CVA16VP1反應(yīng)，一株單抗(7B2)為抗His標(biāo)簽的單抗。
　　二、CAV6結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位的定位與分析
　　為進(jìn)一步研究CVA6 VP1蛋白的抗原表位的定位，我們采用重組抗原Mapping策略，表達(dá)了一系列長(zhǎng)度不同、大小不等的重組肽段。以各VP1截短蛋白作為抗原，通過間接ELISA法分

8、析與所制備的CAV6 VP1單克隆抗體的免疫反應(yīng)性，評(píng)價(jià)其免疫反應(yīng)性和特異性，結(jié)果如下:
　　A.利用基因重組技術(shù)成功表達(dá)了一系列截短的CVA6 VP1重組蛋白，分別為:CVA6-VP11-305、 CVA6-VP110-305、CVA6-VP162-305、 CVA6-VP187-305、CVA6-VP1115-305、CVA6-VP1145-305。均以包涵體形式表達(dá)。
　　B.可以識(shí)別CVA6、EV71和CVA16 V

9、P1重組蛋白的單克隆抗體6C1，可以被CVA6 VP1截短蛋白CVA6-VP11-305、 CVA6-VP110-305識(shí)別，但不與CVA6-VP162-305、 CVA6-VP187-305、CVA6-VP1115-305、 CVA6-VP1145-305反應(yīng)，說明CVA6 VP1蛋白N端10-62aa區(qū)段含有腸道病毒(EV71、CVA6和CVA16)共同性表位。
　　C.可以識(shí)別CVA16 VP1重組蛋白，但不識(shí)別EV71VP

10、1重組蛋白的兩株單克隆抗體5A8、4A3，可以被CVA6 VP1截短蛋白CVA6-VP11-305、 CVA6-VP110-305、CVA6-VP162-305反應(yīng)，但不與CVA6-VP187-305、CVA6-VP1115-305、 CVA6-VP1145-305反應(yīng)，說明，CVA6 VP1蛋白N端62-87aa區(qū)段含有柯薩奇病毒（CVA6和CVA16）的共同性表位。
　　D.綜上所述，我們的研究結(jié)果表明:
　　(1) C

11、VA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1及其截短蛋白片段在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá);
　　(2) CVA6結(jié)構(gòu)蛋白VP1有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，但與EV71、CVA16的抗血清有顯著的交叉反應(yīng)性，所以不宜作為診斷抗原進(jìn)行CVA6血清學(xué)的特異性檢測(cè);
　　(3) CVA6 VP1蛋白N端10-62aa區(qū)段含有腸道病毒CVA6、EV71和CVA16的共同性表位。
　　(4) CVA6 VP1蛋白N端62-87aa區(qū)段含有柯薩奇病毒CVA6和CV