定量蛋白質(zhì)組學(xué)與生物信息學(xué)結(jié)合研究TLR信號通路以及MyD88的復(fù)合物.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是生物體抵御微生物感染的第一道防線。自從在果蠅里發(fā)現(xiàn)Toll樣受體在真菌感染下能有效地誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)開始，越來越多的證據(jù)表明天然免疫系統(tǒng)能夠特異性識(shí)別病原菌的入侵。天然免疫系統(tǒng)識(shí)別的對象是一類結(jié)構(gòu)保守的病原微生物，即病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。而天然免疫系統(tǒng)中的受體則稱之為模式識(shí)別受體(pattern recognition recept

2、ors，PRRs)。PRRs對PAMPs的特異性識(shí)別有效地監(jiān)測了病原微生物的入侵并且誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。Toll樣受體就是一類非常重要的模式識(shí)別受體(PRRs)，能識(shí)別細(xì)菌，真菌，核酸，病毒等等。目前已發(fā)現(xiàn)十多種Toll樣受體，他們不僅在天然免疫系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也是連接天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的橋梁。對TLR信號通路的研究對免疫學(xué)的發(fā)展來說是至關(guān)重要的，目前對TLR信號通路的研究主要是通過分子生物學(xué)在基因?qū)用嫔线M(jìn)行的。

3、在蛋白層面上，缺乏大規(guī)模的研究數(shù)據(jù)。本論文依托基于質(zhì)譜的細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（AACT/SILAC）和生物信息學(xué)分析，在蛋白層面上對TLR信號通路及其關(guān)鍵接頭蛋白MyD88的復(fù)合物進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究工作。
　　論文的第一章介紹了近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)在方法和技術(shù)路線上的發(fā)展概況，強(qiáng)調(diào)了本文所用的氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(AACT/SILAC)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步綜述了目前基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)相互作用的一些傳統(tǒng)生

4、物學(xué)研究方法以及生物信息學(xué)預(yù)測分析，并且指出各自的優(yōu)缺點(diǎn)。由以上這些技術(shù)背景介紹引出了本論文的研究背景;并且在最后闡述了本論文的研究目的和意義。論文的研究工作主要分三部分，第一部分主要研究的是LPS短時(shí)間刺激下巨噬細(xì)胞亞細(xì)胞組分的TLR4信號通路變化;第二部分主要是初步探索LPS以及Zymosan刺激巨噬細(xì)胞時(shí)TLRs受體的主要接頭蛋白內(nèi)源性MyD88的蛋白復(fù)合物情況;第三部分主要是改進(jìn)了第二部分的免疫沉淀方法并結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的信息來研

5、究LPS刺激時(shí)內(nèi)源性MyD88復(fù)合物的變化。下面將詳細(xì)介紹各章內(nèi)容:
　　（一）亞細(xì)胞定量蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)解析LPS短時(shí)刺激下引起的巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR4信號通路的變化
　　脂多糖LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素的主要成分，LPS作為一個(gè)主要的促炎癥因子，以污染的形式廣泛存在于空氣顆粒中包括大氣污染、有機(jī)粉塵、香煙霧等地方。作為天然免疫系統(tǒng)的第一道防線，Toll樣受體4(TLR4)能夠特異性的識(shí)別脂多糖并且激活調(diào)節(jié)一系列的信

6、號轉(zhuǎn)導(dǎo)以此來激活受感染宿主的免疫炎癥反應(yīng)。對于TLR4通路的研究中，盡管已經(jīng)有大量參與到該通路的基因和蛋白的功能得到了驗(yàn)證，但是大部分研究都是通過傳統(tǒng)生物學(xué)手段以單個(gè)基因或蛋白為研究對象來進(jìn)行的。目前為止對由LPS所誘導(dǎo)的TLR4信號通路的整個(gè)調(diào)控機(jī)制及網(wǎng)絡(luò)仍然缺乏大規(guī)模系統(tǒng)性的研究，可以說現(xiàn)在所得到的TLR4信號通路仍然是很不完整的，還有很多未知的東西可以探索。
　　通過之前的一些研究成果，我們發(fā)現(xiàn)大部分信號通路都在脂多糖(LP

7、S)感染宿主的初期階段就被激活。因此，我們選擇了細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的這一強(qiáng)大的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來對活體巨噬細(xì)胞受到LPS感染后，蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的差異表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)的研究。通過對細(xì)胞器的分離（細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)）不僅可以有效降低樣品分離的復(fù)雜性，提高了質(zhì)譜對樣品的鑒定能力，并且可以發(fā)現(xiàn)某些有意義的低豐度信號蛋白在特定細(xì)胞器中得到了富集，從而使我們更好的了解宿主受感染后它們是如何發(fā)揮作用的。通過這一亞細(xì)胞定量蛋白組學(xué)的方法，在細(xì)

8、胞受到LPS刺激10分鐘后，在細(xì)胞質(zhì)中鑒定到508個(gè)蛋白發(fā)生了上調(diào)，103個(gè)蛋白發(fā)生了下調(diào);與此同時(shí)，在細(xì)胞核中鑒定到678個(gè)上調(diào)蛋白，80個(gè)下調(diào)蛋白。我們對鑒定到的兩部分蛋白進(jìn)行了基本的生物信息學(xué)功能分析，發(fā)現(xiàn)在S1胞質(zhì)部分，差異表達(dá)的蛋白主要參與了蛋白代謝，蛋白修飾，細(xì)胞周期，凋亡等生物學(xué)過程;而S3核部分蛋白更多的參與了RNA剪接、DNA/RNA代謝、轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過程，這與我們采取核與胞質(zhì)和核的亞細(xì)胞分離手段的預(yù)期結(jié)果一致。

9、>　　同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)許多關(guān)鍵的涉及MAPK通路和NF-κB通路的信號蛋白是在細(xì)胞質(zhì)中被激活，而各類重要的轉(zhuǎn)錄因子比如干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs)則在細(xì)胞核中被激活。通過生物信息學(xué)的分析，我們構(gòu)建了各個(gè)被激活信號通路的串聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖并將這一網(wǎng)絡(luò)圖延伸到了細(xì)胞凋亡的調(diào)控中。更為重要的是，借助生物信息學(xué)分析，我們第一次在蛋白層面上全面系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)到了這些上游激活的信號通路是如何相互串聯(lián)來調(diào)節(jié)激活下游的轉(zhuǎn)錄因子的。而激活的轉(zhuǎn)錄因子又調(diào)控了一系列促炎癥

10、因子的表達(dá)從而參與到多種生物學(xué)過程包括蛋白和核酸代謝，DNA損傷修復(fù)，細(xì)胞周期調(diào)控以及宿主防御等等。對TLR4通路的全面解析對相關(guān)的免疫性疾病的診斷、治療、預(yù)防等具有重要的指導(dǎo)意義。
　　（二）結(jié)合傳統(tǒng)免疫共沉淀及AACT技術(shù)初步探索TLR2、TLR4信號通路中內(nèi)源性MyD88的復(fù)合物
　　目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13個(gè)TLR家族，雖然不同的TLR所識(shí)別的PAMPs不同，但髓樣分化因子88(myeloid differentiation

11、 factor 88，MyD88)是除了TLR3以外所有TLR家族路中關(guān)鍵的接頭分子，是信號向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵靶蛋白。MyD88可以通過其死亡結(jié)構(gòu)域(Death Domain，DD)募集下游信號分子使信號下傳，激活一系列的下游信號通路，這些激活的下游通路又互相關(guān)聯(lián)來控制炎癥反應(yīng)。因此研究MyD88的復(fù)合物能使我們更好的了解宿主受到感染時(shí)TLRs信號通路的調(diào)控機(jī)制。
　　現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展很多與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的方法用于大規(guī)模研究蛋白相互作用

12、，比如串聯(lián)親和純化（TAP技術(shù)）以及體內(nèi)雙標(biāo)簽技術(shù)等，但是這些技術(shù)都會(huì)涉及到在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建標(biāo)簽蛋白，這就在一定程度上改變了細(xì)胞的生理環(huán)境以及蛋白特性。而且內(nèi)源性靶蛋白可能與標(biāo)簽蛋白產(chǎn)生競爭作用。因此研究蛋白相互作用最理想的方法是用免疫共沉淀的方法直接把內(nèi)源性的靶蛋白復(fù)合物pull down下來。然而傳統(tǒng)免疫沉淀的缺點(diǎn)在于背景高，沉淀下的復(fù)合物很可能是假陽性的。這里我們將AACT/SILAC技術(shù)與傳統(tǒng)免疫沉淀相結(jié)合，很好的彌補(bǔ)了免疫沉淀的這

13、個(gè)缺陷，通過質(zhì)譜鑒定后的定量信息篩選出特異性相互作用的蛋白復(fù)合物。
　　這里我們使用TLR4受體的配體LPS以及TLR2受體的配體Zymosan刺激巨噬細(xì)胞，結(jié)合上述方法鑒定挑選出了82個(gè)受LPS刺激后以及56個(gè)受Zymosan刺激后與內(nèi)源性MyD88相互作用增強(qiáng)的蛋白復(fù)合物。并通過生物信息學(xué)對它們進(jìn)行了初步功能分析。表明了MyD88及其復(fù)合物在調(diào)控TLR4以及TLR2通路上的異同點(diǎn)。
　?。ㄈ┗贏ACT的磁珠免疫共沉淀

14、和蛋白結(jié)構(gòu)域信息鑒定和分析LPS刺激下RAW264.7細(xì)胞中內(nèi)源性MyD88的復(fù)合物
　　傳統(tǒng)瓊脂糖免疫共沉淀的方法雖然能研究生理?xiàng)l件下的蛋白復(fù)合物，但是由于步驟太多，容易產(chǎn)生誤差，損失弱相互作用蛋白。這里我們利用商品化的磁珠protein A beads取代傳統(tǒng)瓊脂糖protein A beads，大大簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了細(xì)胞用量。我們將這一改進(jìn)的免疫共沉淀與AACT/SILAC技術(shù)相結(jié)合，鑒定篩選出了161個(gè)在LPS刺激后與

15、內(nèi)源性MyD88相互作用增強(qiáng)的蛋白。
　　生物信息學(xué)在蛋白相互作用中的預(yù)測和驗(yàn)證中起到了重要作用。蛋白相互作用通常不需要蛋白全長的參與，而是通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來完成的。一些數(shù)據(jù)庫通過對以往所得蛋白相互作用數(shù)據(jù)的研究而歸納總結(jié)出結(jié)構(gòu)域相互作用的規(guī)律，這些規(guī)律可以被用來旁證新得到的相互作用蛋白的可信度。
　　這里我們應(yīng)用蛋白結(jié)構(gòu)域聚類的方法對我們所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)我們所得到的數(shù)據(jù)有結(jié)構(gòu)域聚類的現(xiàn)象，含有這些結(jié)構(gòu)域的蛋白會(huì)涉

16、及多個(gè)生理學(xué)過程，說明MyD88會(huì)募集不同功能的蛋白來共同協(xié)調(diào)整個(gè)TLR信號通路。我們進(jìn)一步通過對蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用的分析，預(yù)測了這些蛋白復(fù)合物兩兩之間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MyD88募集的復(fù)合物主要可以分為3層，最有可能和MyD88發(fā)生直接相互作用的蛋白是第一層相互作用蛋白，這類蛋白主要涉及激酶活性等功能從而很好的激活上游的信號級聯(lián)通路。通過與第一層相互作用蛋白的連接，第二層相互作用蛋白接收到這些信號，并調(diào)動(dòng)了一系列蛋白來參與涉及多個(gè)生