水稻白葉枯病隱性抗病基因xal3的分離與鑒定.pdf

1、華中農業(yè)大學博士學位論文水稻白葉枯病隱性抗病基因xal3的分離與鑒定姓名：儲昭暉申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：張啟發(fā);王石平20051201華中農業(yè)大學博士學位論文2 0 0 5中文摘要植物抗病基因的研究一直以來是植物分子生物學研究領域的熱點之一，迄今已經從不同的宿主中分離了5 0 多個抗病基因，其中僅有6 個是隱性基因，這些隱性抗病基因的作用機理目前尚不能用廣為接受的顯性基因的作用機理來進行解釋．水稻中已經鑒定

2、3 2 個主效抗白葉枯病基因，其中9 個為隱性抗病基因。位于第8 染色體長臂末端的x a l 3基因就是其中的一個典型，它完全隱性抗性、特異性的抗白葉枯病菌菲律賓菌系生理小種6 ( P X 0 9 9 ) 、和其它顯性或隱性抗白葉枯病基因存在抗性互作，說明x a l 3 基因抗病機理的特異性．為克隆x a l 3 基因，采用基因組飽和雜交的原理，在9 個發(fā)育時期取材構建了水稻品種明恢6 3 全生育期均一化c D N A 文庫．以分子標記

3、E 6 a 和另一端標記S 1 4 0 0 3 為起始，構建了x a l 3 基因區(qū)段的物理圖譜，并結合3 個F 2 群體和S h o t g u n 測序結果將該基因定位f 一個9 ．2 k b 的D N A 片段上。同時通過精細物理定位x a l 3 基因，開發(fā)了數(shù)個與該基因緊密連鎖的基于P C R 技術的分子標記，為采用分子標記輔助選擇x a l 3 育種提供了經濟、方便的分子標記。在優(yōu)化了一套適合于水稻品種I R B B l 3

4、 的轉基因組培體系的基礎上，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，將攜帶顯性候選基因的片段轉入到攜帶隱性抗病基因的水稻品種I R B B l 3 中，在4 5 株轉基因植株后代中，有全長基因導入的3 0 株的袁型變?yōu)楦胁?，并? 個單拷貝轉基因的T l 代家系也符合共分離檢測，從而驗證了候選基因是x a l 3 基因的顯性基因X a l 3 ，標志用圖位克隆法成功克隆了隱性基因x a l 3 和顯性基因X a l 3 。同時，通過R N A 干

5、擾( R N A i ) 技術，分別抑制水稻品種明恢6 3 和中花I l 中顯性基因X a l 3的表達，以及水稻品系I R B B l 3 中隱性基因的表達．通過接種自葉枯病菌P X 0 9 9 和定量R T - P C R 分析發(fā)現(xiàn)，明恢6 3 和中花l l 中X a l 3 基因表達受到抑制的植株表型由感病變?yōu)榭共　? R B B l 3 中x a l 3 基因表達受到抑制的植株抗性進一步加強。有趣的是，顯性基因X a l 3 和

6、隱性基因x a l 3 在花藥中的表達量高于二在葉片中的表達盛。R a N A i 轉基因植株中X a l 3 或x a l 3 的表達受到抑制會導致植株不育或半不育，組織學觀察發(fā)現(xiàn)這些不育單株的多數(shù)花粉的發(fā)育停留在單核花粉期或二核花粉期。原位雜交的實驗證明， 腸鄺基因在花藥中表達的時期與異?；ǚ郯l(fā)生的時期1 # 常一致．X a l 3住花粉發(fā)育的早期不表達，在單核花粉期開始高水平表達。從而說明X a l 3 基因在花粉的發(fā)育中也起著重

7、要的作用．進一步通過大量實驗表明，顯性基因X a l 3 是一個受病原調控表達的基因，由顯性瑤岡X a l 3 突變成隱性基因x a l 3 的關鍵不是編碼區(qū)內的變化，而是在啟動子區(qū)的一個約1 8 b p 的區(qū)間內的突變使基因表達受病原調控的能力喪失，且這種突變不影響其在花粉中的表達。X A l 3 蛋白是～個未知具體生化功能的細胞膜蛋白，屬于M t N 3 家族的成員之一．但其在白葉枯病菌P X 0 9 9 侵染以及在花粉的發(fā)育中發(fā)揮