白細(xì)胞介素24抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)放療敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤的治療仍是目前神經(jīng)外科學(xué)界的難題之一。盡管近些年來(lái)在手術(shù)、放療、化療等方面不斷取得進(jìn)步,然而幾十年來(lái)膠質(zhì)瘤的平均生存期并沒(méi)有明顯改觀。分子生物學(xué)、遺傳學(xué)的進(jìn)步促進(jìn)了惡性膠質(zhì)瘤基因治療的發(fā)展。在眾多的在研基因中白細(xì)胞介素24(interleukin-24,IL-24)越來(lái)越受到廣泛關(guān)注,IL-24屬于白介素10細(xì)胞因子家族,因最初被發(fā)現(xiàn)在終末分化的人類(lèi)黑色素瘤中高度表達(dá),也被稱(chēng)為黑色素瘤分化相關(guān)因子-7(mda-7)基因。

2、　　 研究證實(shí)IL-24對(duì)肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多種癌細(xì)胞均有選擇性的抑制作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),將IL-24基因轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性得到明顯增強(qiáng)；將IL-24基因轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞,可明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放、化療的治療作用。
　　 在本研究中我們用新型重組腺病毒作載體攜帶IL-24基因(Ad5F35-IL24),分別轉(zhuǎn)染體外的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和在體的人膠質(zhì)瘤組織,觀察IL

3、-24基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞的影響以及IL-24與放射治療聯(lián)合應(yīng)用是否相互協(xié)同增效,并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 第一部分
　　 目的:觀察IL-24基因?qū)β闶笤隗w人膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)是否存在抑制作用,并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法:建立人膠質(zhì)瘤U251的動(dòng)物模型,瘤內(nèi)注射Ad5F35-IL24,觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)腫瘤組織中IL-24蛋白、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表

4、達(dá)情況；通過(guò)原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織的凋亡情況；通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織的血管密度,以及bFGF、VEGF的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:Ad5F35-IL24轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤后IL-24蛋白高度表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織和對(duì)照組相比較:腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制(P<0.05)；其凋亡率明顯升高(P<0.05)；Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.01)；微血管生成明顯減少(P<0.05)；VEGF和bFGF表

5、達(dá)亦明顯減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論:IL-24具有抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用,誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和抑制膠質(zhì)瘤微血管生成可能是其主要的作用機(jī)制。進(jìn)一步的研究表明促凋亡蛋白Bax的上調(diào)和抗凋亡蛋白Bcl-2的下調(diào)可能是IL-24誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制；誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤組織中VEGF和bFGF表達(dá)的減少可能是IL-24抑制膠質(zhì)瘤微血管生成的作用機(jī)制。
　　 第二部分
　　 目的:探討放射性粒子125I在動(dòng)物體內(nèi)抗人膠

6、質(zhì)瘤的效果及其作用機(jī)制。
　　 方法:建立人膠質(zhì)瘤U251的動(dòng)物模型,瘤內(nèi)植入放射性粒子125I,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,在電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化,采用原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織的凋亡情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)Bax、Bcl-2的表達(dá),并應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)血管密度和VEGF、bFGF的表達(dá)。
　　 結(jié)果:人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的動(dòng)物模型成功完成,植入放射性粒子125I后,膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯受到抑制,電鏡下可呈現(xiàn)核碎

7、裂,核染質(zhì)邊聚等細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征,檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織的Bax/Bcl-2(1.88±0.47)明顯高于對(duì)照組(1.11±0.52),P<0.01；實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織凋亡率的IHS評(píng)分(3.64±0.89)明顯高于對(duì)照組(0.81±0.45),P<0.01；實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織的微血管密度IHS評(píng)分(1.40±0.55)明顯低于對(duì)照組(3.23±0.87),P<0.01；實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織VEGF的IHS評(píng)分(1.58±0.55)明顯低于對(duì)照組(

8、4.19±0.45),P<0.01；實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織bFGF的IHS評(píng)分(2.44±0.89)低于對(duì)照組(3.52±0.79),P<0.05。
　　 結(jié)論:放射性粒子125I對(duì)在體人膠質(zhì)瘤U251有明確的抑制作用,促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡和降低瘤組織微血管密度是其主要作用機(jī)制。
　　 第三部分
　　 目的:分別觀察體外IL-24與X射線,體內(nèi)IL-24與放射性粒子125I聯(lián)合應(yīng)用是否可協(xié)同抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng),并探討其可能的作用機(jī)

9、制。
　　 方法:用Ad5F35-IL24和X射線分別或聯(lián)合干預(yù)體外的U251細(xì)胞系,通過(guò)MTT法檢測(cè)各組的抑制率,通過(guò)Hochest33258法檢測(cè)各組的凋亡率,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組的Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況,通過(guò)WesternBlot分析各組U251細(xì)胞的IL-24、PKR、p-PKR、p38-MAPK、p-p38-MAPK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平；用Ad5F35-IL24與放射性粒子125I分別或聯(lián)合干預(yù)

10、在體的膠質(zhì)瘤組織,通過(guò)TUNEL法測(cè)定各組腫瘤組織的凋亡情況,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組腫瘤組織的Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組腫瘤組織的血管密度,以及各組腫瘤組織bFGF、VEGF的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干預(yù)組U251細(xì)胞的抑制率和凋亡率均明顯增高(P<0.001),Bax/Bcl-2升高(P<0.05),PKR、p38MAPK蛋白的表達(dá)和活化都明顯增高(P<0.001)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

11、結(jié)果同樣證實(shí)同其余各組相比:聯(lián)合干預(yù)組腫瘤組織的凋亡率明顯增高(P<0.001),Bax/Bcl-2明顯升高(P<0.05),PKR、p38MAPK蛋白的表達(dá)和活化都明顯增高(P<0.001)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合干預(yù)組的微血管生成較其余組明顯減少(P<0.05),VEGF和bFGF的表達(dá)也明顯減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論:無(wú)論在體內(nèi)外,IL-24和放射治療對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞均具有協(xié)同殺傷作用,推測(cè)其機(jī)制可能是通過(guò)使Bax