稻瘟病菌一個新抗藥性標記基因的應用研究.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是生產中最具破壞性的致病真菌之一，每年可造成10％-30%的糧食產量損失。隨著稻瘟病菌及其宿主水稻全基因組序列測序工作的完成，加快了對病原菌致病性相關基因的研究進程，同時也為研究宿主-病原菌相互作用提供了理論基礎。從分子水平解析稻瘟病菌致病及變異機制對有效防控該病害的發(fā)生及發(fā)展具有重要的理論與實踐意義。
　　目前，稻瘟病菌主要通過基因敲除、過表達和熒光蛋白融合等方法來進行基因功能研究

2、。但是，大部分基因重組整合位點往往是隨機的，由此帶來的位置效應可能會干擾基因自身或是相關功能基因的表達。本研究利用紫外線（UV）對稻瘟菌進行輻射突變，獲得一株萎銹靈抗性菌株，經測序發(fā)現(xiàn)，該突變菌株琥珀酸脫氫酶 B亞基（sdi1）第245位氨基酸發(fā)生突變。利用該點突變（H245L）作為篩選標記，對已知載體 pCAMBIA1300進行改造，使其成為具有萎銹靈抗性篩選標記，并能定點插入Mosdi1位點的重組載體 pMoC-eGFP。通過農桿菌

3、介導的轉化方法得到 pMoC-eGFP定點重組的突變體，對抗性菌株進行PCR及Southern雜交驗證，表明該載體定點、單拷貝整合至基因組Mosdi1位點的效率高。實驗結果表明，突變株在產孢量、孢子形態(tài)、生長速率等方面與野生型菌株相比未發(fā)生明顯改變，同時，突變體對大麥和水稻（敏感品種CO-39）的致病性也未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。因此，可以將Mosdi1位點作為目的基因整合位點，以實現(xiàn)目的基因在稻瘟菌株中的穩(wěn)定表達。此外，該載體包含酵母重組區(qū)，

4、可以不依賴限制性酶切位點，實現(xiàn)多個DNA片段的一步連接。與傳統(tǒng)基因回補及定位研究方法相比，該系統(tǒng)快速、高效等優(yōu)點，對稻瘟病菌基因功能研究具有重要的意義。
　　目前，本實驗室利用該定點整合系統(tǒng)，完成了稻瘟菌Morak1、Mopmt2及Mokhd4三個基因的定點回補及定位載體構建工作。上述部分菌株進行Southern雜交及半定量RT-PCR驗證，表明突變體中目的基因均以單拷貝形式整合在Mosdi1位點下游。以上結果進一步表明，在上述系