栽培楊梅譜系地理、馴化起源及品種（系）間關(guān)系的研究.pdf

1、楊梅（Morella rubra Lour.）屬楊梅科(Myricaceae)楊梅屬（Morella Lour.），是一種特產(chǎn)于中國的著名水果，自然分布于中國和鄰近的東亞各國。楊梅屬在中國分布有4個種，分別為楊梅、毛楊梅（M.esculenta）、青楊梅（M.adenophora）和云南楊梅（M.nana），其中只有楊梅被馴化為水果。我國的野生楊梅群體分布很廣，在華東、華南至西南11個省區(qū)均有存在，是栽培楊梅的主要種質(zhì)資源庫。栽培楊梅在

2、中國馴化已有2000多年，目前已形成浙江、江蘇、福建、廣東等多個主要栽培區(qū)。目前，關(guān)于楊梅系統(tǒng)地位、野生楊梅群體遺傳結(jié)構(gòu)及歷史動態(tài)、栽培楊梅的馴化起源及品種間關(guān)系一直沒有得到很好解決。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，基于二代高通量測序中的簡化基因組測序技術(shù)RAD-seq研究了楊梅的系統(tǒng)地位;通過對楊梅葉綠體全基因組分析，基于篩選的具有多態(tài)性的cpDNA片段，并結(jié)合核SSR及RAD-seq分子標(biāo)記分析了野生楊梅群體的遺傳多樣性及歷史動態(tài)、栽培楊梅

3、的馴化起源以及不同楊梅栽培品種（系）之間的關(guān)系。得到的以下主要創(chuàng)新性研究結(jié)果:
　　(1)楊梅的系統(tǒng)地位及種間、種內(nèi)分化歷史
　　利用二代高通量RAD-seq測序技術(shù)對供試樣品在全基因組水平上進(jìn)行掃描，共篩選到了4253個基因座含有8360個簡約性信息位點(diǎn)和3677個非連鎖SNP位點(diǎn)。以北美香蕨木（Comptonia peregrina）為外類群，利用最大簡約法(MP)、最大似然法(ML)和貝葉斯推斷法(BI)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育

4、樹，揭示在中國4個種中，支持毛楊梅位于基部，楊梅和青楊梅形成了很好的姐妹群關(guān)系，再與云南楊梅構(gòu)成支持率很高的單系;結(jié)果同時揭示楊梅屬在北美分布的種類（M.cerifera和M.pensylvanica）與東亞物種形成了間斷分布的姐妹群關(guān)系。
　　利用BEAST對種間、種內(nèi)分化時間進(jìn)行估算，用兩個二次校正點(diǎn)進(jìn)行校正，推測楊梅屬中國4個種的分化是在12.72 Ma完成的，楊梅（Morella rubra）的物種形成時間大概在中新世與上

5、新世的交界處(5.28 Ma)，到上新世晚期(3.39 Ma)楊梅種內(nèi)開始分化。楊梅種內(nèi)的分化以及向東向北遷移很可能是由喜馬拉雅山脈隆升引發(fā)橫斷山脈的形成而導(dǎo)致中國南亞熱帶生態(tài)環(huán)境的劇變所引起的。
　　通過對楊梅不同群體4個個體的一致性序列進(jìn)行比對，在楊梅種內(nèi)篩選到了3808個非連鎖SNP位點(diǎn)，為進(jìn)一步解析野生楊梅的群體遺傳結(jié)構(gòu)、親緣地理以及栽培楊梅的馴化起源提供一個有效的分子工具。同時，對原始數(shù)據(jù)中不含酶切位點(diǎn)序列進(jìn)行拼接、組裝

6、和注釋后，通過與公共數(shù)據(jù)庫比對，獲得了與楊梅果實(shí)成熟與衰老、果實(shí)品質(zhì)和疾病/防御相關(guān)的基因以及所涉及的信號通路。
　　(2)楊梅葉綠體基因組測序及分析
　　基于前人葉綠體基因間隔區(qū)psb A-trnH構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，從中選取分別代表廣布單倍型H1、單倍型H3和H4的三個楊梅個體進(jìn)行了葉綠體全基因組測序。平均每個樣品得到4.76G的原始數(shù)據(jù)，reads長度為125 bp，堿基質(zhì)量超過Q20的百分比介于93.14％-93.4

7、5％之間。通過組裝、拼接后三個楊梅個體的葉綠體基因組全長分別為159，440bp、159，612bp和159，567bp。
　　楊梅葉綠體基因組的測序、注釋及序列分析結(jié)果表明:該葉綠體基因組呈閉合環(huán)狀，與大多數(shù)被子植物基因組結(jié)構(gòu)一樣，整個基因組共由4部分組成:一個大單拷貝區(qū)（LSC，Large Single Copy region），一個小單拷貝區(qū)(SSC，Small SingleCopy region)，兩個反向互補(bǔ)重復(fù)區(qū)(IR

8、s， Inverted Repeat regions)，GC含量大約占36.1％。在整個葉綠體基因組中共定位到117個不同的基因，其中74個蛋白質(zhì)編碼基因，32個不同tRNA編碼基因，4個rRNA編碼基因，4個保守開放閱讀框和3個假基因。將三個楊梅葉綠體基因組比對后，共檢測到322個變異位點(diǎn)，其中單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)有272個，插入-缺失變異(indel)49個，通過對SNP位點(diǎn)篩選及引物設(shè)計，共得到了9個可用于楊梅群體遺傳結(jié)構(gòu)

9、、親緣地理分析的cpDNA片段。
　　(3)楊梅野生群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及進(jìn)化歷史分析
　　基于9對SSR分子標(biāo)記以及從上述9個cpDNA片段中篩選的4個cpDNA片段，分析了楊梅野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。核SSR結(jié)果顯示，楊梅的遺傳多樣性總體處于中等水平（Ho=0.615，HE=0.472）?；赾pDNA序列變異在楊梅野生群體中共檢測到53個變異位點(diǎn)，其中51個單點(diǎn)突變和2個插入缺失，共獲得了17個單倍型。相對

10、于核SSR水平，楊梅野生群體在cpDNA水平上具有較低的遺傳多樣性（h=0.195，π=0.0.000325）。線性回歸分析表明，僅核苷酸多態(tài)性(π)隨著緯度的升高而降低（r=0.170，p=0.036）呈現(xiàn)較為明顯的負(fù)相關(guān)，其它遺傳多樣性參數(shù)與經(jīng)緯度沒有存在明顯的相關(guān)性。
　　AMOVA分析顯示，在cpDNA水平上，楊梅野生群體間(88.17％)的遺傳分化大于群體內(nèi)(11.83％)，而在核SSR水平上群體間(18.89％)的遺傳

11、分化小于群體內(nèi)(81.11％)?；诤薙SR（FST=0.189）和cpDNA（FST=0.882）群體間的遺傳分化指數(shù)得出Nm值分別是1.07和0.07，而楊梅野生群體間的花粉流和種子流之比為30，表明楊梅群體間的基因流以花粉流為主。
　　首次利用RAD-seq對野生楊梅群體間親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，從供試樣品中共篩選到了83，225個非連鎖SNP位點(diǎn)。結(jié)合cpDNA和核SSR的分析結(jié)果，顯示西南地區(qū)為楊梅在中國大陸的祖先分布區(qū)，云

12、南的野生楊梅具有祖先群體的特征。失配分布(MDA)分析顯示楊梅野生群體沒有發(fā)生過群體擴(kuò)張，但單倍型網(wǎng)絡(luò)圖表現(xiàn)出有群體擴(kuò)張信號。地理隔離效應(yīng)(IBD)分析顯示楊梅群體遺傳分布格局和地理分布模式?jīng)]有顯著的相關(guān)性，與楊梅為風(fēng)媒傳粉植物相吻合。但是，cpDNA單倍型的譜系地理揭示其多態(tài)性主要分布在南嶺以南的南亞熱帶地區(qū)，南嶺以北的華中和華東分布的野生楊梅的單倍型比較單一，值得進(jìn)一步研究。
　　(4)楊梅栽培群體遺傳多樣性、馴化起源及品種（

13、品系）間的關(guān)系
　　基于9對SSR分子標(biāo)記對楊梅野生和栽培群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，從基因多樣性（Hs）、等位基因豐富度(AR)、期望雜合度（HE）、觀察雜合度(HO)以及特有等位基因豐富度（PR）來說，楊梅野生群體的遺傳多樣性略高于栽培群體，表明在馴化過程中受到了一定的人工選擇?；赗AD-seq全基因組掃描得到結(jié)果揭示栽培楊梅與野生群體分化已明顯，作者認(rèn)為栽培楊梅就近取材引種、再通過長期營養(yǎng)繁殖保持農(nóng)藝性狀是造成此

14、現(xiàn)象的原因。
　　基于核SSR和RAD-seq兩種不同的分子標(biāo)記對栽培楊梅馴化起源進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明，兩種分子標(biāo)記共同揭示栽培楊梅在中國經(jīng)歷了多次相對獨(dú)立的馴化事件。揭示浙江栽培群體經(jīng)歷了兩次馴化過程，福建栽培群體是單獨(dú)馴化起源的，江蘇的部分栽培品種（品系）是外地引入的;來自于不同主栽區(qū)的‘東魁’品種是由一次獨(dú)立馴化事件完成的;結(jié)合人類“就近馴化”的習(xí)慣，提出目前主要栽培楊梅品種（品系）是分別來源于浙江、江西、福建等地的野生

15、群體，并且是經(jīng)過多次引種馴化完成的。
　　同樣，利用核SSR和RAD-seq分子標(biāo)記并結(jié)合果實(shí)性狀（農(nóng)藝特征）對栽培楊梅不同品種（品系）間的關(guān)系進(jìn)行了分析。研究表明，RAD-seq由于能夠提供更多的信患位點(diǎn)，因而揭示的結(jié)果比核SSR、1SSR、RAPD等標(biāo)記的結(jié)果更加清晰可靠，栽培楊梅不同品種間的親緣關(guān)系與品種原產(chǎn)地之間有比較大的相關(guān)性，大部分相近產(chǎn)地的不同品種（品系）表現(xiàn)出共同的種質(zhì)遺傳基礎(chǔ);所收集到的39個品種在NJ樹上被分為

16、4個譜系，經(jīng)省級鑒定的12個品種在每個譜系中都有分布，其中譜系1和譜系2各含有一個品種，分別為‘烏酥’和‘八賢道’，譜系3包含有‘東魁’和‘丁岙’，譜系4可分為2個分支，其中第1個分支包含‘早色’、‘大葉細(xì)蒂’、‘小葉細(xì)蒂’和‘烏梅’，而‘早薺’、‘晚稻’、‘晚薺’和‘荸薺’被分在第2個分支內(nèi);結(jié)合果實(shí)性狀（農(nóng)藝特征）分析顯示，東魁是遺傳和形態(tài)上相對穩(wěn)定的品種，蘇州‘大葉細(xì)蒂’(SZDY)和‘小葉細(xì)蒂’(SZXY)，臺州‘桐子’(TZT