吸煙者人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和骨向分化能力的對比研究.pdf

1、吸煙是牙種植的重要風(fēng)險因素。很多研究已經(jīng)證實，煙草的使用可負(fù)面影響種植體的成功率。臨床研究證實，吸煙負(fù)面影響種植體的成功率，吸煙者不僅牙種植體的失敗率比非吸煙者高，而且感染種植體周圍炎的幾率也比非吸煙者高。吸煙通過減少膠原蛋白生成、減少外周血液循環(huán)、損害白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能，從而影響了傷口的愈合。此外，一系列的基礎(chǔ)研究表明，煙草的煙霧或者尼古丁的刺激負(fù)面影響鈦種植體周圍的骨質(zhì)。然而目前吸煙對種植體骨結(jié)合的影響的細(xì)胞機(jī)制大都是通過建立吸

2、煙模型來研究的，但是煙草煙霧的刺激和注射尼古丁是不能夠完全模擬人長期吸煙對機(jī)體細(xì)胞的影響。本實驗取材自非吸煙者和吸煙者牙種植體部位的頜骨骨髓，分離培養(yǎng)人的頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，對比分析吸煙者頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（smoker human alveolar bone marrow mesenchymal stem cells s-hABMMSCs）和非吸煙者頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（nonsmoker human alveolar bone

3、marrow mesenchymal stem cells n-hABMMSCs）的增殖和骨向分化能力，來評估吸煙因素對人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。為吸煙對種植體骨結(jié)合的影響提供理論依據(jù)。主要研究成果如下：
　　實驗一：人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　目前BMMSCs的培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)基本成熟，本實驗采用密度梯度離心法、貼壁法和有限稀釋法成功分離培養(yǎng)出了hABMMSCs。初期貼壁的細(xì)胞大多是短梭形或者不規(guī)則形狀，胞

4、核大且聚中，胞體豐滿，有1～2個細(xì)長突起向外呈放射狀，具有成體干細(xì)胞的特征。之后可見細(xì)胞的形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，呈典型的漩渦狀生長。相同培養(yǎng)條件下，吸煙組的細(xì)胞生長速度明顯慢于非吸煙組。本實驗用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，非吸煙組與吸煙組干細(xì)胞在分子表型上呈現(xiàn)相似的特征。兩組干細(xì)胞均陽性表達(dá)STRO-1、CD146、CD105、CD90、CD29、CD44，這些都是間充質(zhì)干細(xì)胞的特異表達(dá)標(biāo)記，陰性表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的分子表型CD31和造血系細(xì)胞的分

5、子表型CD34、CD45。非吸煙組STRO-1、CD146的表達(dá)11.5％、5.9％要大于吸煙組11.3％、3.5％。
　　這一部分實驗，我們首次從吸煙者的頜骨骨髓中成功分離培養(yǎng)出了頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用非吸煙者的頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照，并對兩組細(xì)胞的干細(xì)胞特性進(jìn)行了鑒定。分離培養(yǎng)的吸煙者的頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長速度比非吸煙者慢，并且干細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞受體STRO-1、CD146的表達(dá)量也比非吸煙者少。
　　實驗二

6、：非吸煙組與吸煙組hABMMSCs增殖能力的比較
　　本實驗通過MTT法、克隆形成實驗、流式細(xì)胞周期檢測三種方法對非吸煙組與吸煙組人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增值能力進(jìn)行了系統(tǒng)的比較和分析，MTT檢測顯示非吸煙組與吸煙組表現(xiàn)出了明顯的增殖差異，s-hABMMSCs顯示出了較差的體外增殖能力，其增殖活力明顯弱于n-hABMMSCs。自接種培養(yǎng)后第三天起，這種差異表現(xiàn)的更加明顯；克隆形成實驗也證實，s-hABMMSCs的克隆形成能力比n-

7、hABMMSCs差，流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果同前兩種檢測結(jié)果一樣，s-hABMMSCs處于增殖期的細(xì)胞比例比n-hABMMSCs少，s-hABMMSCs的生長增殖能力弱于n-hABMMSCs，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　以上結(jié)果表明吸煙組的hABMMSCs增殖能力弱于非吸煙組，這說明吸煙者影響頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，，這可能是由于吸煙組的細(xì)胞均取自長期重度吸煙者，煙草中的有害物質(zhì)長期高濃度刺激細(xì)胞，從而抑制了細(xì)胞的增殖。<

8、br>　　實驗三：非吸煙組與吸煙組hBMMSCs骨向分化能力的比較
　　本實驗通過ALP活性檢測實驗、體外礦化能力檢測、Real-time PCR檢測的方法分析對比非吸煙組與吸煙組hABMMSCs骨向分化能力。ALP活性實驗結(jié)果表明兩組細(xì)胞在14天內(nèi)ALP活性都呈上升的趨勢。吸煙組細(xì)胞的增長速度明顯慢于非吸煙組。在3、7、14三個時間點(diǎn)上，s-hABMMSCs的ALP活性均低于n-hABMMSCs。體外礦化能力檢測結(jié)果表明，兩組細(xì)

9、胞成骨誘導(dǎo)三周后，n1、n2、n3和s1、s2、s3均有紅褐色的礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，從形態(tài)上看，吸煙組的礦化結(jié)節(jié)面積小、密度低且排列分散，而非吸煙組的礦化結(jié)節(jié)面積大，而且密度高。對兩組的圖片中的礦化面積進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，吸煙組的礦化結(jié)節(jié)面積明顯少于非吸煙組。定量分析結(jié)果顯示和面積分析的結(jié)果相同，吸煙組的成骨能力明低于于非吸煙組。用RT-PCR從RNA水平檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示骨向分化的相關(guān)基因ALP、COL-1、BSP、CON的表

10、達(dá)，吸煙者都要低于非吸煙者。
　　大量研究報道，吸煙與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生有關(guān)系，而吸煙者的頜骨骨質(zhì)普遍也比非吸煙者差，同時，吸煙者的骨內(nèi)種植體的成功率也低于非吸煙者，并且戒煙能夠升高吸煙者的成功率。本實驗我們比較了兩組細(xì)胞的骨向分化能力，通過一系列實驗證明了s-hABMMSCs的骨向分化能力n-hABMMSCs差。這說明了是煙草中的有害物質(zhì)調(diào)節(jié)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)，使得hABMMSCs礦物質(zhì)支架的形成和礦物質(zhì)的沉積，使新骨生成的數(shù)量