純鈦表面不同處理對骨髓間充質(zhì)干細胞礦化的影響.pdf

1、目的:鈦金屬具有優(yōu)良的理化性能,生物相容性好、耐腐蝕,成為口腔種植體的主要材料。目前研究發(fā)現(xiàn),純鈦表面的形貌特征是影響骨結(jié)合的重要因素,它可以影響細胞的黏附、增殖和分化,進而決定了純鈦與骨界面的結(jié)合速率,純鈦表面形貌對提高種植的成功率有至關重要的作用。研究表明,鈦表面粗化處理可明顯提高種植體的骨結(jié)合率,粗化處理已經(jīng)成為鈦表面改性的一個重要的研究方向。噴砂酸蝕的表面優(yōu)化處理方法能提高純鈦表面的粗糙度,從而提高純鈦表面與周圍骨組織的骨結(jié)合率

2、,提高種植的早期穩(wěn)定性。骨髓間充質(zhì)干細胞是一種具有增殖和分化潛能的多能干細胞,種植體植入后,其在種植體表面附著、增殖、分化、礦化,直接影響著種植體骨整合的形成。目前已有研究觀察了骨髓間充質(zhì)干細胞在不同處理的純鈦表面的附著特點,但有關骨髓間充質(zhì)干細胞在不同處理的純鈦表面增殖、礦化的研究尚不多見。本實驗通過不同方法對鈦片表面進行處理,制備出具有不同特征的粗化純鈦表面形貌,通過體外實驗來觀察不同處理純鈦表面對骨髓間充質(zhì)干細胞附著及礦化的影響,

3、探討有利于促進純鈦表面礦化形成的純鈦表面處理方式,從而為臨床種植體的開發(fā)提供更為準確而可靠的實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1鈦片的制備及分組
　　 選取直徑10mm,厚度1mm純鈦片15枚,Ra0.8μm,分為3組,每組5枚。
　　 A組(TiO2砂粒噴砂HCl/H2SO4雙重酸蝕組):80目TiO2砂粒在5Kp氣壓下進行表面粗化,HCl/H2SO4混合液酸蝕;
　　 B組(Al2O3砂粒噴砂H

4、Cl/H2SO4雙重酸蝕組):80目Al2O3砂粒在5Kp氣壓下進行表面粗化,HCl/H2SO4混合液酸蝕;
　　 C組(光滑組):表面不做任何處理。
　　 2不同處理純鈦表面形貌的掃描電鏡觀察
　　 掃描電鏡下觀察TiO2砂粒噴砂HCl/H2SO4雙重酸蝕組鈦片、Al2O3砂粒噴砂HCl/H2SO4雙重酸蝕組鈦片和光滑組鈦片的表面形貌。
　　 3骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 清潔級SD

5、大鼠6只,雌性,3～4周齡,體重100～110克,抽取股骨和脛骨內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞,采用密度梯度離心法進行分離和純化,常規(guī)原代及傳代培養(yǎng)。通過Vimentin免疫細胞化學染色對細胞進行鑒定。
　　 4不同處理純鈦表面骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及礦化誘導
　　 將第2代生長良好的骨髓間充質(zhì)干細胞制備成單細胞懸液,分別滴加到3組不同處理的純鈦表面以及作為空白對照的玻片表面進行培養(yǎng)。同時,加入誘導礦化劑對各組表面的細胞進行誘導。<

6、br>　　 5不同處理純鈦表面骨髓間充質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng)后的生長情況和礦化結(jié)節(jié)的形態(tài)的掃描電鏡觀察
　　 誘導培養(yǎng)11天后掃描電鏡下觀察各組鈦片表面骨髓間充質(zhì)干細胞細胞的生長情況及礦化結(jié)節(jié)的形態(tài)。
　　 6礦化結(jié)節(jié)的鑒定
　　 通過茜素紅、硝酸銀染色對誘導后形成的礦化結(jié)節(jié)進行鑒定。
　　 7礦化結(jié)節(jié)的計數(shù)
　　 體視顯微鏡下計數(shù)各組鈦片表面礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量。
　　 8統(tǒng)計學處理
　　

7、 所有數(shù)據(jù)均以(-x)±SD表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和SNK-q檢驗,P＜0.05,有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1不同處理鈦片表面形貌的掃描電鏡觀察
　　 TiO2砂粒噴砂HCl/H2SO4酸蝕處理與Al2O3砂粒噴砂HCl/H2SO4酸蝕處理的純鈦表面形貌相似,均形成大小不一,凹凸不平的一級窩洞及二級窩洞,窩洞邊緣較為圓鈍。未經(jīng)處理的光滑純鈦表面相對光滑,可見蜂窩狀淺表

8、窩洞,排列緊密。
　　 2骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定
　　 倒置熒光顯微鏡下可見原代骨髓間充質(zhì)干細胞為不規(guī)則的梭形或三角形,有兩個或多個細胞突起。傳代后細胞形態(tài)以長梭形為主,呈現(xiàn)出成纖維細胞樣形態(tài)。Vimentin免疫細胞化學染色結(jié)果:傳代細胞細胞漿呈棕黃色或黃褐色著色,呈陽性表達。
　　 3骨髓間充質(zhì)干細胞誘導后形成礦化結(jié)節(jié)的鑒定
　　 硝酸銀染色顯示,細胞密集區(qū)域可見大面積黑色及黑褐色團塊;茜素紅染色顯示

9、,細胞密集區(qū)域可見大面積橘紅色團塊。說明在細胞密集區(qū)域有大量鈣鹽沉積,即為礦化結(jié)節(jié)。
　　 4骨髓間充質(zhì)干細胞在鈦片及玻片表面生長及礦化的掃描電鏡觀察
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞在各組鈦片及玻片表面均生長良好,形成細胞層,在各個表面均可形成礦化結(jié)節(jié)。
　　 TiO2砂粒噴砂HCl/H2SO4酸蝕鈦片表面骨髓間充質(zhì)干細胞呈重疊復層生長,細胞外形不規(guī)則,細胞偽足伸展明顯。表面可見大量的密集的球形礦化結(jié)節(jié),許多小結(jié)節(jié)又聚集

10、融合形成更大的結(jié)節(jié)。
　　 Al2O3砂粒噴砂HCl/H2SO4酸蝕鈦片表面骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量有所減少,細胞外形不規(guī)則,細胞有偽足伸出,偽足數(shù)量較少。表面可見少量的球形礦化結(jié)節(jié),僅有個別小結(jié)節(jié)繼續(xù)融合形成更大的結(jié)節(jié)。
　　 光滑鈦片表面骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量明顯減少,偽足伸展不充分,甚至無偽足伸展。鈦片表面僅可見稀疏的球形礦化結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)數(shù)量稀少,未見到結(jié)節(jié)融合的現(xiàn)象。
　　 玻片表面細胞伸展明顯,但未見有偽足伸出

11、,平鋪于玻片表面。玻片表面礦化結(jié)節(jié)礦化程度不明顯,未見結(jié)節(jié)融合的現(xiàn)象
　　 5體視顯微鏡下計數(shù)三組鈦片表面礦化結(jié)節(jié)數(shù)量(每個鈦片均按順時針方向旋轉(zhuǎn)一周,計數(shù)五個視野),以(-x)±SD表示。
　　 鈦砂酸蝕組:133.0±8.2,鋁砂酸蝕組:91.3±18.0,光滑對照組:34.3±9.6。
　　 6統(tǒng)計學分析
　　 TiO2砂粒噴砂酸蝕組(133.0±8.2)、Al2O3砂粒噴砂酸蝕組(91.3±18.