克羅卡林對(duì)急性腦缺血再灌注大鼠MG、iNOS的影響.pdf

1、背目的
　　 急性腦梗死是腦血管疾病( cerebrovascular disease，CVD)的最常見類型，約占CVD的70％。腦缺血再灌注是腦缺血缺氧后重新恢復(fù)血流的過程，是臨床上常見的病理生理現(xiàn)象。缺血再灌注對(duì)恢復(fù)半暗帶區(qū)域(Ischemic Penumbra，IP)腦組織的血液供應(yīng)以及功能改善有重要作用，但缺血再灌注也對(duì)腦組織造成一定損傷。
　　 在腦缺血再灌注損傷的過程中，過度炎癥免疫反應(yīng)引起的病理損傷是重要的

2、損傷機(jī)制之一。小膠質(zhì)細(xì)胞( microglia，MG)是腦內(nèi)的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理過程中起重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)顱內(nèi)的內(nèi)環(huán)境改變及其敏感，當(dāng)腦內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活，產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性因子，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，加重對(duì)腦部的損害。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是人體內(nèi)一種重要的合酶，在腦缺血再灌注損傷時(shí)誘導(dǎo)合成表達(dá)，使鈉離子大量?jī)?nèi)流，導(dǎo)致

3、腦細(xì)胞水腫，損害神經(jīng)元。K-ATP通道開放劑克羅卡林(Cromakalin)以細(xì)胞內(nèi)的ATP/ADP水平為門控因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道。K-ATP通道廣泛存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，也存在小膠質(zhì)細(xì)胞上，它的激活開放是機(jī)體缺血缺氧狀態(tài)下的自我保護(hù)機(jī)制，可以對(duì)抗損害因子對(duì)機(jī)體的傷害。目前有關(guān)K-ATP通道開放劑克羅卡林對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用以及小膠質(zhì)細(xì)胞、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)等方面研究較少，機(jī)制不清楚。
　　 本研究采用大鼠大

4、腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，觀察大鼠急性腦缺血再灌注后神經(jīng)缺損改變、腦內(nèi)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)情況，神經(jīng)元特異性尼氏染色法檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目及K-ATP通道開放劑克羅卡林干預(yù)后的變化，為K-ATP通道開放劑盡早應(yīng)用于臨床治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：72只健康雄性SD大鼠，體重220±30g，隨機(jī)分為3組：A組為假手術(shù)組，B組為單純?nèi)毖?/p>

5、灌注組，C組為克羅卡林干預(yù)組，每組24只分6h、24h、72h、7d，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只。
　　 2．動(dòng)物模型制備：應(yīng)用改良Zea Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠蘇醒后參照Zea Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)【3】進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：1-3分動(dòng)物入選，，0、4分動(dòng)物、開顱后發(fā)現(xiàn)腦蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锛霸俟嘧⒑?4小時(shí)之內(nèi)死亡的動(dòng)物棄之不用，隨機(jī)等量補(bǔ)齊按原方案重新造模進(jìn)行。
　　 3．

6、動(dòng)物處理：C組在MCAO后2h給予克羅卡林(0.4mg/kg/d)2ml腹腔注射。B組在MCAO后2h給予生理鹽水2ml腹腔注射。A組除了不插入線栓其他同B組。達(dá)到各時(shí)間點(diǎn)后，用10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用生理鹽水和4％多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注固定，取腦，制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4μm)。
　　 4．觀察指標(biāo)：達(dá)各時(shí)間點(diǎn)大鼠處死前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。采用免疫組化染色（SP法）檢測(cè)CA1區(qū)OX42（小膠質(zhì)

7、細(xì)胞的標(biāo)志）、iNOS的表達(dá)變化情況。各組取7d時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色，每組取6張切片，在400倍視野下計(jì)數(shù)神經(jīng)元。
　　 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x士s）表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析( one-way, ANOVA)，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1．動(dòng)物神經(jīng)行為評(píng)分：A組大鼠

8、清醒后無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，B、C組大鼠在造模后再灌注6h清醒狀態(tài)下神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異不明顯（P＞0.05）。在其他時(shí)間點(diǎn)B組與C組神經(jīng)功能缺損相比，C組神經(jīng)功能缺損較B組顯著減輕（P＜0.05）。
　　 2．免疫組化染色海馬CA1區(qū)OX42的表達(dá)情況：A組、B組、C組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)OX42均有表達(dá)，A組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)OX42表達(dá)變化不明顯，B、C兩組6小時(shí)開始表達(dá)，24小時(shí)明顯增多，72小時(shí)達(dá)高峰，7天仍有表達(dá)，明顯高

9、于A組各時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)；C組各時(shí)間點(diǎn)OX42表達(dá)均少于B組(P＜0.05)。
　　 3．免疫組化染色海馬CA1區(qū)iNOS的表達(dá)情況：A組、B組、C組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)iNOS均有表達(dá)；A組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)iNOS表達(dá)變化不明顯；B、C兩組6小時(shí)開始表達(dá)，24小時(shí)明顯增多，72小時(shí)達(dá)高峰，7天仍有表達(dá)，明顯高于A組各時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)；C組時(shí)間點(diǎn)iNOS表達(dá)均少于B組(P＜0.05)。
　　 4．神經(jīng)元尼氏染色：

10、A組神經(jīng)元60.66±6.62個(gè)，B組神經(jīng)元11.50±3.08個(gè)，C組神經(jīng)元29.33±4.88個(gè)，三組之間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1．急性腦缺血再灌注損傷后可引起大鼠海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，誘導(dǎo)性一氧化氮合酶表達(dá)增多，并隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)，對(duì)腦組織產(chǎn)生損害作用。
　　 2．克羅卡林可抑制海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，抑制誘導(dǎo)性一氧化氮合酶表達(dá)，減少缺血再灌注對(duì)腦組織