再生性胰腺提取物對體外胰島--間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系的促進(jìn)作用研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　糖尿病對人類健康存在嚴(yán)重威脅，其危害性在世界范圍內(nèi)持續(xù)加深。糖尿病患者需依賴胰島素制劑來控制血糖，但存在著難以避免的胰島素抵抗和致命的低血糖風(fēng)險(xiǎn)。隨著移植技術(shù)和免疫療法的迅速發(fā)展，全胰腺移植和胰島移植已成為治療糖尿病的可行方法。相較于全胰腺移植，胰島移植操作更為方便，同時(shí)具有更高的安全性和有效性。但目前仍存在供體短缺，移植后胰島長期存活率低及功能不全的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem ce

2、ll，MSC)，分離于人新鮮臍帶組織，其免疫調(diào)節(jié)及旁分泌保護(hù)性細(xì)胞因子促進(jìn)組織修復(fù)的能力已被廣泛認(rèn)同，可被選作為細(xì)胞支持劑用于促進(jìn)體內(nèi)外胰島存活和功能維持。然而，由于移植后早期移植物血供難以及時(shí)建立（體內(nèi)移植后胰島微血管再生常需7-14天），移植物遭受缺血缺氧打擊，早期就發(fā)生凋亡壞死，胰島-間充質(zhì)干細(xì)胞共移植效果亦難以令人滿意。因此如何有效抑制胰島β細(xì)胞凋亡，保護(hù)胰島功能為胰島移植的關(guān)鍵所在。Hardikar等首次發(fā)現(xiàn)切除STZ誘導(dǎo)的糖

3、尿病小鼠80-90％胰腺組織后，小鼠血糖可自行恢復(fù)到正常水平。提示損傷后殘留的胰腺組織可能有較強(qiáng)修復(fù)再生能力，或可通過分泌保護(hù)性因子促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生。Fu YS等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該損傷后殘留的胰腺組織（即再生性胰腺）提取物可以加強(qiáng)MSC的旁分泌作用。本實(shí)驗(yàn)于體外通過設(shè)立先低氧(5％O2)后轉(zhuǎn)為正常氧濃度(18％O2)的培養(yǎng)條件來模擬胰島移植后體內(nèi)微環(huán)境，觀察在此模擬環(huán)境下，再生性胰腺提取物（regenerative pancreatic e

4、xtract，RPE）對胰島-間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系的優(yōu)化促進(jìn)作用，即對該共培養(yǎng)體系中胰島β細(xì)胞體外存活和功能維持的影響。
　　材料與方法:
　　1、利用酶消化法聯(lián)合連續(xù)密度梯度離心分離大鼠胰島組織，提取切除掉60％組織三天后的殘留胰腺組織蛋白，添加到胰島-間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)于模擬體內(nèi)的體外微環(huán)境中。
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　實(shí)驗(yàn)Ⅰ組:正常胰島+MSC+再生性胰腺提取物
　　實(shí)驗(yàn)Ⅱ組:分離于再生性胰腺

5、的胰島+MSC
　　對照組:正常胰島+MSC
　　各組先于5％低氧下培養(yǎng)14天（體內(nèi)移植后胰島微血管再生需要7-14天）后轉(zhuǎn)為18％常氧下培養(yǎng)至60天。觀察在該體外模擬環(huán)境下各組胰島細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)改變和功能變化。
　　2、低氧培養(yǎng)早期（培養(yǎng)3天時(shí)）Western Blot檢測各組胰島β細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白caspase-3表達(dá)情況。
　　3、低氧培養(yǎng)3天時(shí)ELISA檢測各組培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)胞因子水平，包括人來源VEGF、b-F

6、GF和大鼠來源IL-1β的分泌量。
　　4、分別收集第3、7、14、21、30、45、60天各組培養(yǎng)基測量insulin分泌量，以及于第14、60天檢測高糖刺激后insulin分泌變化。
　　結(jié)果:
　　我們共觀察了60天胰島-間充質(zhì)干細(xì)胞在該模擬環(huán)境下的培養(yǎng)情況，各組胰島形態(tài)均出現(xiàn)一定程度改變。尤其在低氧培養(yǎng)期，位于胰島細(xì)胞團(tuán)中心及邊緣的β細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡壞死，甚至破碎死亡。其中實(shí)驗(yàn)Ⅰ組胰島破壞程度最輕，且在常氧培養(yǎng)

7、后出現(xiàn)一定程度的改善。在低氧培養(yǎng)3天時(shí)檢測各組細(xì)胞因子水平，相較于對照組，人源VEGF、b-FGF水平在實(shí)驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組均有明顯升高（分別為P＜0.01，P＜0.05），同時(shí)鼠源IL-1β則明顯低于對照組(P＜0.01）。各組胰島素基礎(chǔ)分泌及高糖刺激后水平亦有明顯差異。體外培養(yǎng)3天時(shí)，對照組胰島素水平最高，自第7天起開始明顯低于實(shí)驗(yàn)Ⅰ組，直到本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)第60天(P＜0.01)。于培養(yǎng)14天、60天時(shí)高糖刺激胰島素分泌試驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)Ⅰ組刺激

8、后胰島素水平最高達(dá)約4倍其基礎(chǔ)水平，而Ⅱ組和對照組僅增加約50％。
　　結(jié)論:
　　再生性胰腺組織可自我分泌抗凋亡及組織修復(fù)因子來減少胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其修復(fù)再生;還可通過提高間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌VEGF、b-FGF等保護(hù)性細(xì)胞因子的能力同時(shí)抑制胰島β細(xì)胞自我分泌IL-1β等炎癥性因子來保護(hù)胰島β細(xì)胞形態(tài)與功能。添加再生性胰腺組織提取物可優(yōu)化胰島-間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系，提高胰島β細(xì)胞的體外存活能力、促進(jìn)其功能維持，有望被用