家蠶中一種新的磷酸吡哆醛水解酶的初步研究.pdf

1、維生素B6（VitaminB6,VB6）是自然界中廣泛存在的一類吡啶化合物總稱，包括吡哆醛（pyridoxal，PL）、吡哆醇（Pyridoxine，PN）、吡哆胺（pyridoxamine，PM）、磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5′-phosphate，PLP）、磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5′-phosphate，PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxine-5′-phosphate，PMP）。它們可以相互轉(zhuǎn)化，但PLP是其主

2、要輔酶形式。PLP主要生理功能是參與生物體內(nèi)氨基酸的代謝。PLP的結(jié)構(gòu)中有一個性質(zhì)活潑的醛基，極易與生物體內(nèi)其它含胺基的化合物結(jié)合形成醛亞胺等物質(zhì)，這可能會擾亂生物體內(nèi)正常物質(zhì)水平。細胞中PLP的平衡供給是維持生物健康的關(guān)鍵。
　　PLP代謝在哺乳動物體內(nèi)研究較多，但是對其如何保持動態(tài)平衡的研究還不明確。PLP的調(diào)控因素涉及到PLP磷酸酶，PLK，PNPO，蛋白結(jié)合程度和傳輸機制。PLP的水解是控制細胞內(nèi)游離PLP水平的一個重要機

3、制。相關(guān)水解酶基因的克隆是開展這些研究的基礎(chǔ)。本實驗以模式生物家蠶為材料，由于其特殊的變態(tài)生理，其體內(nèi)氨基酸代謝異常活躍，維持體內(nèi)PLP濃度的動態(tài)平衡的需求在家蠶中更突出。研究家蠶維生素B6的代謝對了解人及其他生物的生理代謝具有重要的參考作用。
　　本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，用人的特異性PLP磷酸酶氨基酸序列對家蠶進行跨物種搜索獲得相似性較高的序列，在家蠶體內(nèi)克隆得到相關(guān)基因（命名為BmPLPP)，該基因ORF序列長1032bp，

4、共編碼343個氨基酸，蛋白分子量為37.9 KD，等電點為8.83，屬非分泌蛋白。預(yù)測顯示家蠶蛋白含有水解酶功能域，與人類特異性PLP磷酸酶同屬于HAD（鹵代酸脫鹵酶）蛋白超家族。多序列比對結(jié)果顯示，BmPLPP和家蠶中已知的堿性磷酸酶的基因和蛋白序列明顯不同，酶學(xué)性質(zhì)相差明顯，認為不是其同工酶。
　　本研究構(gòu)建了測序正確的原核表達載體pET24b（+）-BmPLPP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21（DE3）中進行原核誘導(dǎo)表達

5、，并優(yōu)化了表達條件。SDS-PAGE結(jié)果顯示在上清中獲得到了可溶性目的蛋白。對酶進行Ni-NTA親和層析分離純化目的蛋白，采用紫外分光光度計法分析了酶的活性，并對酶學(xué)性質(zhì)研究認為其為磷為一個新的酸酶，可以水解PLP。該酶的以PLP為底物最適反應(yīng)pH為7.5，在pH7-7.5酶活性較高且穩(wěn)定。最適反應(yīng)溫度為50℃，但在高溫下不穩(wěn)定，而在30℃~40℃較穩(wěn)定。本實驗的酶需要Mg2+激活催化作用，且隨著鎂離子濃度升高，催化作用增強；Zn2+對

6、酶活性產(chǎn)生輕微抑制；而Mn2+、Ca2+、Cu2+、EDTA對酶活性有強烈的抑制作用，隨著濃度升高，抑制作用增強，Mg2+可緩解EDTA的部分抑制作用。
　　最適條件下，以磷酸吡哆醛（PLP）和磷酸吡哆胺（PMP）為底物的Km值分別為0.368mmol/L和0.404 mmol/L，Vmax分別為0.907 umol/min/ug protein和0.394 umol/min/ug protein。這表明該酶對PLP比PMP具有更