人類乙型肝炎病毒e抗原結(jié)合蛋白2（HBEBP2）的克隆表達(dá)與部分功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒的感染不僅引起急慢性病毒性肝炎，而且與肝纖維化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而對(duì)于HBV感染目前尚無特效的治療技術(shù)和方法，這主要是由于HBV感染引起的病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制還有諸多方面沒有研究清楚。近年來，隨著對(duì)HBV致病機(jī)制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在HBV致病機(jī)制中存在著其與肝細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用關(guān)系。為此，本研究所篩選了肝細(xì)胞內(nèi)能與e抗原相互結(jié)合的蛋白，并將其中一個(gè)未知功能新基因命名為乙型肝炎病毒e抗原結(jié)合蛋白2(HBEBP2

2、)。本研究即以此為基礎(chǔ)，通過以下研究?jī)?nèi)容，試圖闡釋該基因的生物學(xué)功能： 1．提取HepG2細(xì)胞總RNA，利用RT-PCR方法在HBEBP2基因的兩端分別引入BamHI和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，獲得目的基因片段，連接至pGEM-T載體，測(cè)序正確后插入至綠色熒光真核表達(dá)載體pEGFP-C1中，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24hr后在熒光倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的綠色熒光信號(hào)，提示HBENP2主要定位于胞核內(nèi)。 2．利用相同

3、方法將引入EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)的HBEBP2基因片段插入至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，1mM/mlIPTG、37℃誘導(dǎo)4.5hr獲得了帶有組氨酸標(biāo)簽的重組融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)。隨后應(yīng)用Western blot對(duì)表達(dá)蛋白的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。 3．將引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的HBEBP2基因片段插入至酵母細(xì)胞表達(dá)載體pG-BKT7中，轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株并獲得表達(dá)。再與含有肝細(xì)胞

4、文庫質(zhì)粒的Y187酵母菌株配合，進(jìn)行酵母雙雜交篩選獲得與HBEBP2相互結(jié)合的已知功能蛋白4種，包括人線粒體蛋白基因、人α-2-糖蛋白1、人甘露糖-p-長(zhǎng)醇利用缺陷1基因和人絲氨酸蛋白酶抑制劑等蛋白基因。結(jié)果提示該蛋白可能與糖基化作用、脂類代謝、細(xì)胞增殖等密切相關(guān)。此外還篩選得到2個(gè)新基因，分別命名為HBEBP2結(jié)合蛋白B(HBEBP2BPB)(GenBank Aceession：DQ499598)和結(jié)合蛋白C(ItBEBP2BPC)(