九龍?zhí)倏傸S酮的提取純化及抗心肌過(guò)氧化損傷作用.pdf

1、目的:
　　1.考察九龍?zhí)倏傸S酮的提取純化工藝。
　　2.研究九龍?zhí)倏傸S酮對(duì)H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　3.研究九龍?zhí)倏傸S酮對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷的作用。
　　方法:
　　1.九龍?zhí)倏傸S酮的提取純化工藝考察
　　1.1、九龍?zhí)倏傸S酮鑒別:以濃氨水反應(yīng)、三氯化鋁反應(yīng)、濃流酸反應(yīng)、鹽酸-鎂粉反應(yīng)、氫硼化鉀反應(yīng)、硅膠薄層色譜法進(jìn)行定性。
　　1.2、九龍?zhí)倏傸S酮含量測(cè)定:以黃

2、芩苷為對(duì)照品,在波長(zhǎng)278.5nm處測(cè)定九龍?zhí)偬崛∥锛状既芤何舛?代入黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到供試品溶液中總黃酮的濃度,按下公式計(jì)算九龍?zhí)倏傸S酮與黃芩苷對(duì)照品對(duì)照所得的總黃酮含量:
　　總黃酮含量(％)=待測(cè)液中總黃酮的濃度×待測(cè)液體積/待測(cè)粗提物重量×100%
　　總黃酮提取率(%)=總黃酮含量×提取物重量(g)/生藥量(g)×100%
　　1.3、九龍?zhí)倏傸S酮的提取:在前期研究的基礎(chǔ)上,以95%乙醇冷浸,并按萃取液

3、極性大小梯度萃取制總黃酮粗品。
　　1.4、九龍?zhí)倏傸S酮的純化方法優(yōu)化:以靜態(tài)吸附率和解吸率為考察指標(biāo),確定大孔樹(shù)脂型號(hào);以總黃酮純度及回收率為指標(biāo),對(duì)九龍?zhí)倏傸S酮的純化工藝進(jìn)行優(yōu)選。
　　2.九龍?zhí)倏傸S酮抗心肌過(guò)氧化損傷作用
　　建立H2O2誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞過(guò)氧化損傷模型與乳鼠心肌細(xì)胞H/R損傷模型,陽(yáng)性藥物組分別以維生素C(Vit.C,終濃度100mg·L-1)、舒血寧(SXN,終濃度為100mg·L-1)預(yù)處理,

4、九龍?zhí)冱S酮組以不同劑量BCF(終濃度分別50、100、200mg·L-1)預(yù)處理。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力;Annexv-FITC/PI雙染法測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡率;ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液腫瘤壞死因子(TNF-α)、總抗氧化活力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量(活性);免疫組化方法觀察Bcl-2、Bax、NF-κβp65蛋白的表

5、達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.優(yōu)化九龍?zhí)倏傸S酮純化工藝條件
　　確定以D101型大孔樹(shù)脂對(duì)九龍?zhí)冱S酮的吸附性能及解析效果較好;最佳純化工藝為:15.5mg·mL-1、pH3-4上樣液,上樣量小于16.85mg·g-1(黃酮/濕樹(shù)脂);上樣速度0.125BV·h-1,柱子徑高比1:6,4BV60%乙醇以1BV·h-1洗脫。總黃酮平均純度48.95%(以黃芩苷為對(duì)照),回收率96.09%。總黃酮提取率為:2.6%(以生藥計(jì))。

6、
　　2.九龍?zhí)倏傸S酮抗心肌細(xì)胞氧化損傷作用
　　2.1、九龍?zhí)倏傸S酮對(duì)H2O2誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的作用:與模型組相比,不同劑量九龍?zhí)冱S酮預(yù)處理均可增加心肌細(xì)胞活力、減少心肌細(xì)胞凋亡率、降低TNF-α、MDA、LDH,提高T-AOC、T-SOD、GSH,上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)(P<0.01或P<0.05)。
　　2.2、九龍?zhí)倏傸S酮對(duì)心肌H/R損傷的作用:心肌細(xì)胞形態(tài)上,光鏡下見(jiàn)乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)3

7、~5天后,心肌細(xì)胞融合成片,呈放射狀,細(xì)胞間由多個(gè)偽足交織成網(wǎng)狀,呈同步化搏動(dòng);H/R模型組心肌細(xì)胞胞漿空泡形成,細(xì)胞偽足減少,折光率下降,并有大量心肌細(xì)胞脫落、懸浮、溶解壞死,搏動(dòng)幅度及頻率降低,節(jié)律不齊;九龍?zhí)倏傸S酮各組可見(jiàn)部分的心肌細(xì)胞偽足回縮,細(xì)胞脫落懸浮現(xiàn)象,損傷程度較模型組顯著減輕,死亡細(xì)胞減少;與模型組相比,不同劑量九龍?zhí)冱S酮預(yù)處理均不同程度的增加細(xì)胞活力,減少心肌細(xì)胞凋亡率、降低TNF-α、iNOS,維持eNOS水平,上

8、調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax、NF-κβ蛋白表達(dá)(P<0.01或P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.從九龍?zhí)偾o中提取總黃酮化合物,以D101大孔吸附樹(shù)脂純化九龍?zhí)倏傸S酮具有較好效果。正交設(shè)計(jì)優(yōu)選所得工藝穩(wěn)定可行,可用于九龍?zhí)倏傸S酮的純化。
　　2.九龍?zhí)倏傸S酮對(duì)H2O2及H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞過(guò)氧化損傷具保護(hù)作用,其機(jī)制可能抗氧化應(yīng)激損傷、升高GSH、T-SOD,清除自由基;減少M(fèi)DA,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化;降低LDH,改