淚液細(xì)胞因子水平在甲狀腺相關(guān)眼病活動分期中的價值探討.pdf

1、研究背景
　　 甲狀腺相關(guān)眼病(Thyroidassociatedophthalmopathy,TAO)是一種與甲狀腺自身免疫疾病密切相關(guān)的眼部疾病，常伴隨著Graves’病(Graves'disease，GD)發(fā)生，臨床上又稱為Graves眼病(Gravesophthalmopathy,GO)，其眼部表現(xiàn)具有顯著的特征:輕者僅有眼部不適、眼瞼退縮;重者出現(xiàn)突眼、復(fù)視，甚至視力喪失。目前還沒有令人滿意的治療方法。
　　

2、TAO發(fā)病機制尚不完全明了，較公認(rèn)的為“共同抗原學(xué)說”，即眼外肌膜成纖維細(xì)胞與甲狀腺交叉抗原表達(dá)，導(dǎo)致眶內(nèi)活性淋巴細(xì)胞浸潤，釋放各種細(xì)胞因子，作用于眼眶組織，引起眼眶的炎癥反應(yīng)，同時刺激成纖維細(xì)胞分泌糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAG)，大量親水性GAG堆積繼而導(dǎo)致眼球突出等一系列臨床癥狀，其中TSHR可能作為主要交叉抗原在TAO發(fā)病機制中起重要作用。球后成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在TAO的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)

3、揮了關(guān)鍵作用，也成為目前較為公認(rèn)的發(fā)病機制所在。之前的研究證實不同分期TAO外周血和球后組織中細(xì)胞因子的表達(dá)具有差異性，活動期顯著升高的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α等可在一定程度上評判眼病活動分期。
　　 作為甲狀腺相關(guān)眼病中受累組織之一的淚腺，在發(fā)病及眼病進(jìn)展中的作用目前尚不明確。影像學(xué)及病理學(xué)研究證實，TAO患者淚腺腫大，淚腺組織淋巴細(xì)胞浸潤和脂肪增生，與球后組織病理改變相似。Eckstein等發(fā)現(xiàn)正常淚腺腺泡細(xì)胞表面表達(dá)促

4、甲狀腺素受體(Thyroitropinreceptor,TSHR)，而TSHR是導(dǎo)致甲狀腺和眼眶發(fā)病的重要交叉抗原。由此，研究者提出假說，淚腺腺泡細(xì)胞可能是TAO發(fā)病中的靶細(xì)胞之一。
　　 臨床上，TAO患者的眼表癥狀突出，包括結(jié)膜充血水腫、流淚或淚液分泌減少、干澀異物感等，與干眼癥相似，亦有研究證實TAO患者淚膜破裂時間縮短，眼表疾病指數(shù)升高，干眼癥狀明顯，引起臨床醫(yī)生和學(xué)者們的重視。既往的研究認(rèn)為眼表癥狀的出現(xiàn)與眼球突出度增

5、加、瞼裂增寬，淚液蒸發(fā)加速導(dǎo)致淚液滲透壓增加相關(guān)，但是近來的研究證據(jù)顯示可能淚腺也參與TAO的干眼癥狀的發(fā)生。
　　 淚腺是眼分泌性免疫系統(tǒng)的主要組織，含有多種淋巴細(xì)胞和免疫活性成分，對眼表的保護作用和免疫功能的發(fā)揮主要依靠分泌淚液實現(xiàn)。淚液中含有復(fù)雜的細(xì)胞因子成分，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，其濃度變化可引起一系列炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致干眼等眼表癥狀，可作為疾病恢復(fù)的信號和干眼癥等眼表疾病的標(biāo)志物。
　　 淚腺腺泡細(xì)胞與球后成纖維細(xì)胞

6、表面同樣表達(dá)TSHR，并出現(xiàn)與活動期球后組織相似的病理改變，由此，我們提出假設(shè):淚腺是否與球后組織一樣存在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡？而作為淚腺分泌物，淚液細(xì)胞因子水平是否可以間接反映淚腺炎癥反應(yīng)和眼病活動性？目前國內(nèi)外此類研究極少，甲狀腺相關(guān)眼病患者淚液細(xì)胞因子表達(dá)情況尚不明確。對TAO患者淚液細(xì)胞因子譜的研究有助于進(jìn)一步從非創(chuàng)性角度去初步探討淚腺在甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病中的作用，對不同活動分期TAO細(xì)胞因子濃度的比較，有助于尋求活動分期的可能指

7、標(biāo)，為臨床治療提供可靠依據(jù)。
　　 液相芯片是基于美國Luminex公司xMAP(flexiblemultianalyteprofiling)技術(shù)的新型芯片技術(shù)平臺，具有高通量、高靈敏度、高特異性的特點，非常適合于同時檢測微量淚液樣本中的多個細(xì)胞因子。對多個細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測與評價比檢測單個細(xì)胞因子更能反應(yīng)疾病發(fā)生與發(fā)展的整體變化。
　　 本研究將應(yīng)用液相芯片技術(shù)分析不同活動分期TAO淚液中IL-6、IL-10、TNF

8、-α、IFN-γ、IL-17、IL-8、和IP-10的水平，了解TAO患者淚液細(xì)胞因子的表達(dá)情況。并隨訪觀察球后放射治療前后各細(xì)胞因子水平的變化，進(jìn)一步探討淚腺、淚液炎癥因子在TAO發(fā)病機制中的可能作用，并尋求甲狀腺相關(guān)眼病活動分期的可能指標(biāo)。
　　 第1章不同分期甲狀腺相關(guān)眼病淚液細(xì)胞因子譜差異性分析
　　 研究目的
　　 利用液相芯片技術(shù)檢測不同分期TAO淚液中5種細(xì)胞因子和2中趨化因子水平，了解TAO患者淚

9、液細(xì)胞因子的表達(dá)情況，并尋求活動分期的可能指標(biāo)。
　　 研究方法
　　 1、研究對象:連續(xù)收集2011.01-2012.02在南方醫(yī)院內(nèi)分泌科和南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的近3個月內(nèi)未行大劑量激素沖擊和其他免疫抑制劑治療的中重度TAO患者47例，按CAS評分標(biāo)準(zhǔn)將其分為活動期27例(CAS≥3)和穩(wěn)定期20例(CAS＜3);同期連續(xù)收集正常對照組10例。收集非刺激性淚液，采用LiquiChipTM液相芯片技術(shù)檢

10、測淚液中IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-8和IP-10的水平
　　 2、統(tǒng)計方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(X)±SD表示，偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)表示。正態(tài)分布的各組間計量資料的分析采用One-wayANOVA，當(dāng)P≥0.05時，認(rèn)為方差齊，用LSD法作進(jìn)一步的多重比較。方差不齊性時，用Welch法校正，并用DunnettT3法進(jìn)一步作多重比較。偏態(tài)分

11、布的計量資料和等級資料的組間比較采用非參數(shù)檢驗，三組間淚液細(xì)胞因子濃度比較采用Kruskal-WallisH檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步組間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗，檢驗水準(zhǔn)采用校正后P值，以P＜0.017為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TAO患者中淚液細(xì)胞因子與促甲狀腺素受體抗體(thyrotropinreceptorantibody，TRAb)和CAS評分的相關(guān)性分析用spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計

12、學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果
　　 1.TAO與正常人淚液細(xì)胞因子表達(dá)情況
　　 細(xì)胞因子IL-6、趨化因子IP10、IL-8在所有57份標(biāo)本中取得結(jié)果(檢出率為100％)，濃度范圍分別為0.32～1583.15pg/ml、58.26～19404.08pg/ml、6098.18～24034pg/ml。TNF-α和IL-10在54份標(biāo)本中檢出（檢出率為94.7％），濃度范圍分別為0.25～121.23pg/ml、0.3

13、3～108.82pg/ml。IL-17僅在1例標(biāo)本中檢出（檢出率為1.8％），IFN-γ在所有的標(biāo)本中均未檢出.
　　 2、TAO組與正常人淚液細(xì)胞因子濃度比較
　　 與正常組相比較，TAO患者淚液IL-6、IL-10、IL-8和IP-10水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001P=0.046P=0.002P=0.026)，而TNF-α在TAO和正常組間無顯著差異(P=0.664)
　　 3、不同TAO分

14、組間淚液細(xì)胞因子濃度比較
　　 IL-6:與正常組比較，活動期TAO組和穩(wěn)定期TAO組淚液IL-6濃度均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(P＜0.001P=0.003)，活動期TAO組和穩(wěn)定期TAO間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，活動期TAO組IL-6顯著高于穩(wěn)定期TAO組(P=0.001＜0.017)。
　　 IL-10:與正常組相比較，活動期TAO淚液IL-10濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);活動組與穩(wěn)定組

15、比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，活動期TAOIL-10濃度顯著高于穩(wěn)定期TAO(P=0.009);穩(wěn)定期TAO組與正常組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.705)
　　 TNF-α:與正常組相比較，活動期TAO組和穩(wěn)定期TAO組淚液TNF-α濃度無顯著差異(P=0.353P=0.555)，活動期TAO組與穩(wěn)定期TAO組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.006)
　　 IL-8:與正常組相比較，活動期TAO淚液IL-8濃度顯著升高，

16、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);活動組與穩(wěn)定組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.017)，穩(wěn)定期TAO組與正常組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044)
　　 IP-10:與正常組相比較，活動期TAO淚液IP10濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004);活動組與穩(wěn)定組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，活動期TAOIP10濃度顯著高于穩(wěn)定期TAO(P=0.004);穩(wěn)定期TAO組與正常組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.307)

17、>　　 4、TAO患者淚液細(xì)胞因子與CAS、TRAb的相關(guān)
　　 TAO患者淚液IL-6、IL-10、TNF-α、IL-8、IP10與活動性評分CAS呈不同程度相關(guān)性(r=0.565，0.415，0.453，0.385，0.469;P＜0.001，0.005，0.002，0.008，0.001)
　　 TAO患者淚液IL-6、TNF-α、IL-8、IP10與TRAb濃度呈不同程度相關(guān)性(r=0.477,0.325,0.

18、314,0.365;P=0.002,0.032,0.032,0.012),IL-10濃度與TRAb無顯著相關(guān)(P＞0.05)
　　 結(jié)論
　　 1、甲狀腺相關(guān)眼病影響淚液細(xì)胞因子水平，與正常人比較，TAO患者淚液細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-8和IP10顯著濃度升高。
　　 2、不同活動分期TAO淚液細(xì)胞因子表達(dá)具有差異性，活動期TAO淚液IL-6、IL-10和IP10濃度顯著高于穩(wěn)定期，并與眼病活動性評分

19、CAS呈正相關(guān)，淚液IL-6、IL-10和IP10濃度在一定程度上可作為活動分期的評判指標(biāo)。
　　 第2章甲狀腺相關(guān)眼病球后放射治療前后淚液細(xì)胞因子水平變化
　　 研究目的
　　 縱向觀察并比較甲狀腺相關(guān)眼病患者淚液中5種細(xì)胞因子和2種趨化因子水平在球后放射治療前后的變化，旨在了解其動態(tài)變化，進(jìn)一步明確淚液細(xì)胞因子在判斷眼病活動分期中的意義。
　　 材料與方法
　　 1.研究對象:第一章中活動期T

20、AO組中接受直線加速器球后放射治療、并完成治療后3個月隨訪的14例TAO患者，男2例，女12例，平均年齡（39.00±11.17）歲。治療后3月收集非刺激性淚液，采用LiquiChipTM液相芯片技術(shù)檢測淚液中IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-8、IP-10和IL-17的水平
　　 2.治療方法球后放射使用美國VARIAN2100C型直線加速器。分次照射劑量為200cGy，總劑量2000cGy(10次/2周)，

21、在模擬機下定位，照射野大小一般為4cmx4cm，機架角度偏轉(zhuǎn)3°～5°，以避開對側(cè)晶體，療程為2周。治療開始時同時口服強的松30mg，1/日，治療結(jié)束后逐漸減量至停藥。
　　 3.臨床相關(guān)指標(biāo)
　　 所有入組患者完成治療前和治療3月后臨床活動評分(CAS)，NOSPECS分級、突眼度及瞼裂寬度測量，同時抽血進(jìn)行甲狀腺功能和TRAb的檢測。CAS、突眼度、瞼裂寬度的測定由2名指定的專業(yè)人員獨立完成，測量結(jié)果意見一致。

22、>　　 4.統(tǒng)計方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以(X)±SD或者中位數(shù)表示。治療前后CAS、突眼度、瞼裂寬度和TRAb濃度比較采用配對t檢驗，治療前后淚液細(xì)胞因子濃度比較采用兩相關(guān)樣本非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果
　　 1、球后放射治療前后臨床指標(biāo)比較
　　 與球后放射治療前比較，治療后3月后CAS評分、TRAb、瞼裂寬度和突眼度均顯著下降，差異具有統(tǒng)計

23、學(xué)意義(P＜0.001P=0.001P=0.005P=0.009)見表2-1
　　 2、治療前后淚液細(xì)胞因子濃度比較
　　 治療后TAO淚液細(xì)胞因子IL-6濃度顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041)其余細(xì)胞因子IL-10、TNF-α、IL-8和IP10濃度無顯著下降(P=0.950P=0.074P=0.096P=0.510)
　　 結(jié)論
　　 1、球后放射治療后TAO淚液IL-6濃度顯著下降。機制