諾帝抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞對化學趨化因子和生長因子刺激的反應(yīng).pdf

1、快速增殖、高度侵襲和活躍的血管生成是腦惡性膠質(zhì)瘤的重要生物學特性，其結(jié)果是嚴重破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能并常因腫瘤占位而致死。盡管近二十年來的惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)、化療、放療甚至基因治療等多種治療措施有明顯進步，但是并未能很好地延長病人的生存期。因此，如同其它腫瘤一樣，探尋惡性膠質(zhì)瘤新的治療靶點和治療方法十分必要和重要。 本課題研究小組近來發(fā)現(xiàn)，G-蛋白偶聯(lián)受體家族中甲?；氖荏w(formylpeptidereceptor，F(xiàn)PR)

2、在惡性膠質(zhì)瘤組織中呈現(xiàn)陽性表達，且與腫瘤級別和微血管密度有密切關(guān)系，即它具有促進腫瘤生長和血管生成的新功能。細菌源性多肽如N-甲?；琢蝓?亮氨酰-苯丙氨酰胺(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF)和一些宿主源性的多肽如來源于腫瘤細胞或其它宿主細胞線粒體的一些多肽，均能與FPR結(jié)合，進而介導細胞的遷移和增殖。這一結(jié)果提示FPR類似于傳統(tǒng)的生長因子受體，可能是腫瘤治療的新靶點。

3、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiareticacid，NDGA)是一種天然的脂氧化酶抑制劑。我們以前的研究結(jié)果表明，NDGA能抑制膠質(zhì)瘤的生長并能促進其分化。我們基于天然NDGA的結(jié)構(gòu)，合成了其手性化合物諾帝(Nordy)。研究發(fā)現(xiàn)，諾帝具有強烈的抗癌效應(yīng)。 鑒于惡性膠質(zhì)瘤中FPR功能意義尚需進一步明確，諾帝抗腫瘤機制是否涉及FPR介導的血管生成作用亦未認識，本課題對此進行了研究。首先，我們觀測了三種常用膠質(zhì)瘤細胞

4、系中FPR的表達及其與細胞分化之間的關(guān)系，并觀察了諾帝對這種表達的影響；然后，重點研究了人源性惡性膠質(zhì)瘤細胞U87上FPR的功能活性即該受體活化后細胞增殖、遷移、[Ca2+]i變化和上調(diào)血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的產(chǎn)生，以及諾帝對FPR這種功能活性和表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)介導的細胞反應(yīng)的抑制作用；最后，

5、我們研究了上述過程中細胞信號分子功能狀態(tài)(磷酸化水平)的變化。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下： 1.采用定量免疫細胞化學技術(shù)，以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和vimentin為膠質(zhì)瘤分化標記物，定量觀測了人膠質(zhì)瘤細胞系U87和BT325及大鼠膠質(zhì)瘤細胞系C6的FPR表達，結(jié)果顯示，三種細胞系均表達有FPR蛋白，分化程度最低的U87細胞FPR表達最高，提示FPR與膠質(zhì)瘤分化有關(guān)。1

6、00μM諾帝處理后三種細胞的上述FPR表達降低(P＜0.05)，但RT-PCR檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)FPRmRNA表達下降(U87細胞)。 2.以U87細胞為實驗材料，以fMLF(100nM)和合成的W-肽(100nM)作為FPR的激動劑，以EGF(10ng/ml)作為EGFR的刺激物，采用48孔趨化小室進行細胞趨化遷移實驗、記數(shù)法檢測細胞增殖、Fura-2AM作指示劑測定細胞的鈣動員、RT-PCR測定VEGFmRNA表達和ELISA法

7、檢測VEGF分泌水平，評估了U87細胞FPR的功能和諾帝(25，50和100μM)對這些功能反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示： (1)fMLF或EGF均能顯著地促進細胞增殖，25μM諾帝未能顯著地影響U87細胞的增殖，但50和100μM諾帝顯著地抑制由fMLF或EGF誘導的U87細胞的增殖。 (2)fMLF，W-肽或EGF可以非常顯著地引起U87細胞的趨化遷移，50和l00μM的諾帝可以抑制此趨化作用。 (3)fMLF和W-

8、肽均以濃度依賴性形式激發(fā)細胞內(nèi)[Ca2+]i的產(chǎn)生，諾帝處理后經(jīng)上述刺激，鈣內(nèi)流的變化呈現(xiàn)為雙相，即當?shù)蜐舛?低于25μM)諾帝處理，細胞內(nèi)[Ca2+]i增強，而高濃度(50μM以上)諾帝處理，[Ca2+]i被抑制。 (4)fMLF刺激FPR后能上調(diào)VEGFmRNA表達和VEGF蛋白分泌水平，并呈濃度依賴性；諾帝顯著降低了fMLF引起的VEGFmRNA表達和蛋白分泌水平的增高。 3.以U87細胞為試驗材料，以fMLF和E

9、GF分別激活FPR和EGFR兩受體，以諾帝為處理藥物，采用Westernblot方法對細胞信號分子MAPKs(ERK、JNK和p38)、Akt、IкB和EGFR(Try992)及EGFR(Try845)的磷酸化水平進行了檢測。結(jié)果顯示，fMLF可以快速而短暫地誘導MAPKs(ERK、JNK和p38)、Akt及IrB的磷酸化。高劑量(50、100μM)諾帝可以顯著削弱此效應(yīng)，并呈劑量依賴性。EGF也以快速而短暫地誘導EGFR(Try992

10、)和EGFR(Try845)的磷酸化，此磷酸化水平被高劑量(100μM)的諾帝所抑制。 上述結(jié)果提示，惡性膠質(zhì)瘤細胞不同程度地表達FPR，并與細胞分化程度相關(guān)；表達于U87細胞的FPR激活后具有多重效應(yīng)(功能)，包括促進瘤細胞增殖、遷移、Ca2+流動和VEGF的產(chǎn)生，而諾帝明顯抑制FPR的表達和功能效應(yīng)；諾帝對MAPKs、Akt、IкB和EGFR蛋白磷酸化水平和鈣動員的抑制作用可能是其抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和血管生成重要分