當(dāng)歸多糖對造血細(xì)胞抗冷凍損傷及冷凍損傷的可恢復(fù)性研究.pdf

1、當(dāng)歸作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“補血、活血”要藥已有數(shù)千年的臨床應(yīng)用歷史。現(xiàn)代實驗研究證明：當(dāng)歸化學(xué)成分復(fù)雜，當(dāng)歸多糖(APS)是其主要化學(xué)成份之一。APS是當(dāng)歸中促進(jìn)造血的有效成分，對正常或貧血小鼠的髓系造血祖細(xì)胞(BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-MK)的增殖分化有顯著的促進(jìn)作用；同時APS在體外可促進(jìn)人紅系、粒單系及混合系造血祖細(xì)胞的增殖分化；另外，在有外源性造血生長因子(HGF)存在的條件下，APS可促進(jìn)臍血單個核細(xì)胞(MN

2、C)總數(shù)，CFU-GM，CFU-E集落數(shù)量增多，且可使臍血單個核細(xì)胞形成大量基質(zhì)細(xì)胞貼壁。但目前尚未見APS對造血細(xì)胞抗冷凍損傷及冷凍損傷的可恢復(fù)性研究的報道。 造血干細(xì)胞移植(HSCT)是將從骨髓、外周血、臍血中分離的造血干細(xì)胞(HSC)移植給受者，從而重建或恢復(fù)受者的造血和免疫功能，現(xiàn)已成為治療惡性血液病和多種實體瘤的有效方法。臍血(umbilicalcord blood,UCB)是繼骨髓及外周血之后又一新的}tSC移植供源

3、，因具有HSC含量高，增殖能力強(qiáng)，免疫原性弱等特點已被應(yīng)用于臨床，但單份臍血HSC含量有限，只能用于低體重小兒移植。為更廣泛地開展臍血HSCT及建立臍血庫，需長期低溫保存臍血造血細(xì)胞。如何在體外將臍血造血細(xì)胞進(jìn)行有效的保存與復(fù)蘇，降低其冷凍損傷，是HSCT治療的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。造血細(xì)胞受到冷凍、解凍過程的損傷，活力會有一定程度下降，但在適當(dāng)條件下，可使造血細(xì)胞活力得到最大程度的保存。除冷凍保護(hù)劑和適當(dāng)?shù)慕禍厮俣?、?fù)溫過程外，目前已發(fā)現(xiàn)

4、某些HGF對提高冷凍的造血細(xì)胞增殖潛力有一定作用。但其價格較昂貴。研究發(fā)現(xiàn)：人參總皂苷能促進(jìn)冷凍骨髓造血細(xì)胞的復(fù)蘇、增殖，提高骨髓細(xì)胞冷凍損傷的可恢復(fù)性。許多植物多糖尤其是中藥多糖對血細(xì)胞發(fā)生有明顯促進(jìn)作用，其是否可以提高冷凍的HSC增殖潛力值得深入探討。 本研究以健康產(chǎn)婦，足月分娩且無并發(fā)癥的臍血為標(biāo)本，分為兩個部分進(jìn)行實驗研究：1.APS對臍血造血細(xì)胞抗冷凍損傷的作用；2.APS對臍血造血細(xì)胞冷凍損傷的可恢復(fù)性與HGF聯(lián)合促

5、進(jìn)冷凍復(fù)蘇后臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的效應(yīng)進(jìn)行研究。本研究旨在為APS在造血細(xì)胞冷凍保護(hù)中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 一、APS對臍血造血細(xì)胞抗冷凍損傷的作用研究 目的：探討APS在臍血造血細(xì)胞冷凍前的抗冷凍損傷作用。 方法： 1.用淋巴細(xì)胞分離液(Fieoll)密度梯度離心法，明膠法，羥乙基淀粉(HES)法分離臍血MNC，分離前后計數(shù)MNC數(shù)，通過計算MNC的得率比較三種分離方法的效率，從而選擇一種快速有效的分離方法。2

6、.將臍血MNC以5％的二甲基亞砜(DMSO)為冷凍保護(hù)劑在液氮中分別凍存1、3.6個月，采用細(xì)胞計數(shù)法，臺盼藍(lán)拒染實驗，造血祖細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)方法，通過比較臺盼藍(lán)拒染率，MNC、CFU-Mix、CD34<'+>細(xì)胞回收率了解凍存不同時間對臍血MNC和造血細(xì)胞活性的影響。3、將分離得到的MNC隨機(jī)分為5組：APS50μg/ml組、APS100μg/ml組、APS200μg/ml組、APS400μg/ml組和對照組。分別

7、加入不同濃度的APS或等量的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，采用細(xì)胞計數(shù)法計數(shù)培養(yǎng)前、后各組的MNC數(shù)，了解APS能否促進(jìn)MNC的增殖。4.將以上各組培養(yǎng)24h后的臍血MNC以5％的DMSO作為冷凍保護(hù)劑，在液氮中保存1個月后取出復(fù)蘇。采用細(xì)胞計數(shù)法，臺盼藍(lán)拒染實驗，造血祖細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)方法，通過研究各組凍存前后MNC、CFU-Mix、CD<,34><'+>細(xì)胞回收率及臺盼藍(lán)拒染率，了解APS在冷凍前作用于臍血造血細(xì)胞，是否能

8、增強(qiáng)臍血造血細(xì)胞耐受冷凍的能力。 結(jié)果：1.三種分離方法中HES組和明膠組的MNC得率明顯高于Ficoll組(P<0.05)，HES組和明膠組的MNC得率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。2.臍血MNC凍存1，3，6個月，比較凍存前后MNC、CFU-Mix、CD34<'+>細(xì)胞回收率及臺盼藍(lán)拒染率顯示差異均無顯著性(P>0.05)。3.APS100μg/ml組和APS200μg/ml組的臍血MNC的增殖倍數(shù)明顯高于對照組(P<0.0

9、5)。4.APS100μg/ml組和APS200μg/ml組的MNC和CFU-Mix回收率較對照組均明顯增高(P<0.05)； APS50μg/ml組、APS100μg/ml組和APS 200μg/ml組的臺盼藍(lán)拒染率較對照組明顯增高(P<0.05)：APS100μg/ml組的以上指標(biāo)均顯示效果最佳；APS各濃度組和對照組比較，CD34<'+>細(xì)胞回收率差異無顯著性(P>0.05)。 結(jié)論：1.HES法和明膠法分離臍血MNC的效

10、率高于Ficoll密度梯度離心法。2.臍血MNC經(jīng)過凍存和復(fù)蘇，細(xì)胞有一定的損傷，但這種損傷并不與凍存時間成正比。3.APS能促進(jìn)臍血MNC的增殖。4.APS能增強(qiáng)臍血造血細(xì)胞抗冷凍損傷的能力。 二、APS對臍血造血細(xì)胞冷凍損傷的可恢復(fù)性研究 目的：探討APS是否具有恢復(fù)臍血造血細(xì)胞冷凍損傷的作用及與HGF聯(lián)合促進(jìn)冷凍復(fù)蘇后臍血造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的效應(yīng)。 方法：1.將復(fù)蘇后的臍血MNC隨機(jī)分為5組：APS50μg/

11、ml組、APS100μg/ml組、APS200μg/ml組、APS400μg/ml組和對照組。復(fù)蘇后立即加入不同濃度的APS，對照組加入等量培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24h，采用MNC計數(shù)，臺盼藍(lán)拒染實驗，造血祖細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)，MTT比色分析法以及流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測APS對臍血造血細(xì)胞冷凍損傷的恢復(fù)性作用。2.冷凍復(fù)蘇后將臍血MNC與HGF組合和不同濃度的APS(50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)共培養(yǎng)14

12、天，計數(shù)MNC總數(shù)、CFU-Mix數(shù)以及用流式細(xì)胞儀檢測擴(kuò)增后CD34<'+>細(xì)胞率。 結(jié)果：1.APS 100μg/ml組和200μg/ml組較對照組臍血MNC數(shù)量與臺盼藍(lán)拒染率均明顯增加，臍血造血細(xì)胞的增殖能力顯著提高，CFU-Mix集落產(chǎn)率也明顯提高(P<0.05)，APS 100μg/ml組的各個指標(biāo)均顯示效果最佳；APS 100μg/ml組的臍血MNC中CD34<'+>細(xì)胞率明顯高于對照組(P<0.05)。2.與對照組