NF-κB誘騙劑誘導(dǎo)大鼠特異性耐受型樹突狀細(xì)胞的構(gòu)建及性能評價(jià).pdf

1、目的:
　　運(yùn)用NF-κB誘騙劑（NF-κB ODN Decoy）構(gòu)建大鼠耐受性樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)，并將其負(fù)載牛Ⅱ型膠原(BⅡC)，對其形態(tài)學(xué)特征、共刺激分子表型以及體外刺激淋巴細(xì)胞的能力等性能進(jìn)行評價(jià)，為最終將其應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　取SD大鼠脾臟單核細(xì)胞，用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為DC，根據(jù)不同處理對培養(yǎng)細(xì)胞分成五組:(1)單純培養(yǎng)DC組

2、(Control-DC):加入細(xì)胞因子直接誘導(dǎo)培養(yǎng);(2) LPS刺激DC組(LPS-DC):在用細(xì)胞因子直接培養(yǎng)第7天加入終濃度為10μg/ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng);(3) Decoy誘導(dǎo)DC組(Decoy-DC):在培養(yǎng)開始加入細(xì)胞因子同時(shí)加入大鼠NF-κB ODN Decoy，使終濃度為5μ mol/L;(4) LPS刺激Decoy-DC組(LPS-Decoy-DC):還需在加入大鼠NF-κ B ODN Decoy培養(yǎng)后第7天加入終濃

3、度10μg/ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng);(5)負(fù)載BⅡC的Decoy-DC組(BⅡC-Decoy-DC):在加入大鼠NF-κ B ODN Decoy培養(yǎng)后第6天時(shí)加入BⅡC，使終濃度為50μ g/ml。
　　對上述培養(yǎng)DC進(jìn)行性能評價(jià):
　?、傧嗖铒@微鏡或Gimsa染色后觀察細(xì)胞形態(tài)特征，臺盼藍(lán)染色法評價(jià)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠DC特異性標(biāo)志0X-62評價(jià)培養(yǎng)DC純度;
　　②流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)細(xì)胞共刺激分子CD80、C

4、D86表達(dá)情況，評價(jià)DC的成熟狀態(tài);
　　③同種異體淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)評價(jià)Decoy誘導(dǎo)的耐受性DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力，并檢測上清液中IFN-γ和IL-10水平。
　　結(jié)果:
　?、俑鲗?shí)驗(yàn)組DC活力均＞92％，大鼠特異性標(biāo)志OX-62的表達(dá)率＞70％;大多數(shù)大鼠脾臟來源DC呈CD80+/CD86-的表型特征;
　?、谂cControl-DC和LPS-DC比較，Decoy-DC組中相對成熟的貼壁細(xì)胞和毛發(fā)樣突起細(xì)胞

5、均較少，細(xì)胞表面共刺激分子CD80和CD86陽性表達(dá)率和（或）表達(dá)強(qiáng)度均呈明顯降低（P＜0.05）;與Control-DC經(jīng)LPS刺激后共刺激分子表達(dá)明顯上調(diào)相比，Decoy-DC經(jīng)LPS刺激后CD80表達(dá)強(qiáng)度以及CD86陽性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度上調(diào)均不明顯（P＞0.05）;
　?、跙ⅡC-Decoy-DC形態(tài)學(xué)與單純Decoy-DC無明顯差別，也同樣呈CD80和CD86低表達(dá);
　?、蹹ecoy-DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力明顯

6、低于Control-DC和LPS-DC(P＜0.05)，同時(shí)，其刺激淋巴細(xì)胞低分泌IFN-γ（與Control-DC和LPS-DC比較P＜0.05），高分泌IL-10（與LPS-DC比較P＜0.05）;與Decoy-DC相目比，LPS-Decoy-DC刺激淋巴細(xì)胞的能力未見明顯提高;
　?、輰ⅡC-Decoy-DC，在不同的抗原存在時(shí)，其刺激淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力有著明顯的不同:與BⅡC作為刺激抗原相比，健康人血清可刺激淋巴細(xì)胞明顯

7、增殖（P＜0.05），高分泌IFN-γ以及低分泌IL-10（P均＜0.05）。
　　結(jié)論:
　?、俦緦?shí)驗(yàn)改良了大鼠脾臟來源DC的培養(yǎng)方法，效果良好，獲得了活性在92％以上，純度在70％以上的DC;
　?、诔晒τ肗F-κ B ODN Decoy策略構(gòu)建了形態(tài)及表型均穩(wěn)定的耐受性DC。它不僅具有相對不成熟的免疫表型，同時(shí)刺激同種異體淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力較低，且抑制淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)向Th1方向偏移，對LPS的刺激表現(xiàn)了一定的穩(wěn)