華癸中生根瘤菌7653R共生固氮相關(guān)基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、華癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)能夠與紫云英共生形成根瘤，具有嚴(yán)格的宿主專一性。本研究利用Tn5-sacB轉(zhuǎn)座子對(duì)7653R菌株進(jìn)行隨機(jī)插入突變，從8000個(gè)突變子中篩選獲得30個(gè)共生缺陷型突變株。使用TAIL-PCR方法克隆了突變株Tn5-sacB側(cè)翼序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)突變株的插入失活基因與百脈根中生根瘤菌(M loti)的未知功能基因有很高的同源性，它們分別為ooa22,1psH,dmtH,gstH

2、和catH。 opa22基因突變株不能形成根瘤，其編碼產(chǎn)物包含257個(gè)氨基酸，分子量為28.1 kDa。序列分析表明：Opa22蛋白與不透明蛋白和表面抗原有88.9％的相似性，該類蛋白主要存在于動(dòng)物和植物病原細(xì)菌中，能參與細(xì)菌與寄主的相互識(shí)別，并刺激感染。根毛卷曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Opa22蛋白可能在共生早期侵染線的形成與根瘤形成階段發(fā)揮作用，其互補(bǔ)菌株HK24能恢復(fù)突變株的結(jié)瘤能力。 lpsH基因突變株形成無(wú)效根瘤，其編碼

3、產(chǎn)物包含397個(gè)氨基酸，分子量為43.6 kDa。序列與結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：LpsH蛋白可能含有一個(gè)信號(hào)肽區(qū)、11個(gè)轉(zhuǎn)膜區(qū)和一個(gè)定位于周質(zhì)空間的O-抗原聚合酶結(jié)構(gòu)域。其中O-抗原聚合酶為催化合成LPS的必要成分。SDS-PAGE研究結(jié)果表明：突變株LPSI的含量明顯低于野生型菌株。植物盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：lpsH基因突變株只有很弱的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力。電鏡觀測(cè)結(jié)果表明：該突變株形成的根瘤含菌細(xì)胞含有少量正常的類菌體和大量正在衰亡的細(xì)胞碎片。因此，

4、LpsH蛋白是參與LPS合成的膜蛋白，在共生固氮過(guò)程中有重要的作用。 dmtH基因突變株也形成無(wú)效根瘤，其編碼產(chǎn)物包含249個(gè)氨基酸，分子量為27.3 kDa。序列分析結(jié)果表明：DmtH蛋白與去甲基甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶有89.6％的相似性，該酶在甲基萘醌合成的最后一步起去甲基作用。甲基萘醌是類菌體電子傳遞鏈的電子受體。因此，DmtH蛋白參與了類菌體的呼吸作用，在共生固氮過(guò)程中也有重要的作用。 gstH基因突變株不能形成根瘤

5、，其編碼產(chǎn)物包含327個(gè)氨基酸，分子量為37.3kDa。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明：GstH蛋白具有谷胱苷肽硫基轉(zhuǎn)移酶(Gst)家族的功能域，Gst能催化還原態(tài)的谷胱苷肽(GSH)通過(guò)巰基連接到多種特異性底物。有研究結(jié)果表明：GSH參與根瘤菌的抗氧化防御反應(yīng)，在共生固氮過(guò)程中有重要的作用。gstH基因能互補(bǔ)突變株的共生能力。 catH基因突變株形成無(wú)效根瘤，其編碼產(chǎn)物包含391個(gè)氨基酸，分子量為42.2kDa。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明

6、：CatH蛋白具有CoA轉(zhuǎn)移酶家族Ⅲ的功能域。雖然有研究表明：CoA轉(zhuǎn)移酶或CoA可能與根瘤菌的共生有關(guān)，但是catH基因是如何影響共生固氮作用仍未查明。植物盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：catH基因突變株只能形成少量的假瘤，其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力也明顯降低。catH基因的雙交換重組缺陷菌株HK33也有相同的Nod<'->共生表型，進(jìn)一步證實(shí)了catH基因的共生功能。 上述研究結(jié)果和結(jié)論，對(duì)研究華癸中生根瘤菌與紫云英的共生固氮機(jī)理有非常重要的理論意