一氧化氮合酶抑制劑對(duì)內(nèi)毒素所致急性肺損傷大鼠肺臟線粒體的影響.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種內(nèi)皮衍生的血管舒張因子，它參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，具有舒張動(dòng)脈、降低血小板粘滯性和抗炎作用，但過量N0及其代謝產(chǎn)物則可致機(jī)體損傷。誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)屬于一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的一種，只有在病理?xiàng)l件下才被激活，其產(chǎn)生的NO不但量大，而且釋放持久，對(duì)機(jī)體有損害。結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶

2、(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)合成的NO在正常機(jī)體主要起生理調(diào)節(jié)作用，對(duì)機(jī)體有益。 急性肺損傷(acute lung injury ALI)是由于各種原因引起的肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生特征性的病理改變而出現(xiàn)的臨床綜合征，重度的ALI即急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress svndrome，ARDS)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明感染、創(chuàng)傷、休克是引起AL

3、I最常見的病因，多因素多系統(tǒng)共同參與和介導(dǎo)了ALI和ArDS的病理過程。國(guó)內(nèi)對(duì)醫(yī)院獲得性肺炎病原菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性桿菌占多數(shù)(>60％)，革蘭氏陰性菌感染成為引起肺損傷最常見的原因，其產(chǎn)生的內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在肺損傷過程中起著重要作用。線粒體作為細(xì)胞的能量亞單位，當(dāng)它受到外界影響時(shí)，導(dǎo)致產(chǎn)能功能障礙，可能是肺臟損傷的重要環(huán)節(jié)。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到NO參與了ALI的病理生理過程，但急性肺損傷時(shí)肺臟

4、線粒體中NO含量和NOS活性如何變化，是否參與ALI病理生理過程，應(yīng)用一氧化氮合酶抑制劑是否能夠改善線粒體的損傷，目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本研究課題采用LPS制備大鼠急性肺損傷模型，觀察肺臟線粒體中NO含量和NOS活性變化，了解肺臟線粒體中NO對(duì)急性肺損傷的作用，探討一氧化氮合酶抑制劑對(duì)內(nèi)毒素所致急性肺損傷大鼠肺臟線粒體的影響。 第一部分提取分離肺臟線粒體的方法研究 目的：建立一種簡(jiǎn)便可行，用來提取肺臟線粒體的方法。

5、 方法：利用兩種不同分離介質(zhì)氯化鉀溶液和蔗糖-Tris-EDTA溶液(STE溶液)，通過低溫離心機(jī)在不同轉(zhuǎn)速下分離出肺臟線粒體，用固定液固定，在電鏡下觀察。 結(jié)果：兩種方法都能分離出肺臟線粒體，但以氯化鉀溶液作為分離介質(zhì)提取的肺臟線粒體有腫脹、自溶和破碎現(xiàn)象，而以STE液為分離介質(zhì)的方法能夠分離出完整的肺臟線粒體。 結(jié)論：以STE液為線粒體分離介質(zhì)來提取肺臟線粒體的方法是一種簡(jiǎn)便可行實(shí)用的方法，可用來觀察藥物對(duì)肺臟線粒

6、體的影響。 第二部分氨基胍對(duì)內(nèi)毒素所致急性肺損傷 大鼠肺臟線粒體的影響 目的：觀察選擇性誘生型一氧化氮合酶抑制劑氨基胍 (Aminoguanidine，AG)對(duì)急性肺損傷大鼠肺臟線粒體功能的影響，并探討其改善急性肺損傷的作用機(jī)制。方法：將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：①空白對(duì)照組；②LPS模型損傷組；③LPS+AG治療組。空白對(duì)照組大鼠經(jīng)舌靜脈注射生理鹽水其余各組注射LPS，3小時(shí)后空白組與

7、模型組腹腔注射生理鹽水而LPS+AG組腹腔注射AG治療。給藥觀察3小時(shí)后，斷頭放血處死大鼠，迅速取出肺組織，勻漿器混勻后，低溫差速離心法提取肺臟組織線粒體，測(cè)定線粒體總ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總一氧化氮合酶(T-NOS)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)的活性，以及線粒體腫脹度、膜流動(dòng)性和線粒體一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量；電鏡觀察大鼠肺臟組織線粒體

8、超微結(jié)構(gòu)的改變及治療藥對(duì)此變化的影響。 結(jié)果 1 在大鼠急性肺損傷后肺臟線粒體總ATP酶、SOD、GSH-Px活性均明顯下降(P<0.01)，線粒體MDA含量明顯升高(P<0.01)。AG治療組與肺損傷組相比總ATP酶、SOD、GSH.Px活性均顯著升高(P<0.01)，MDA含量明顯下降(P<0.01)。 2 在大鼠急性肺損傷后肺臟線粒體中的T-NOS和iNOS活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，N0含

9、量也隨之顯著增多(P<0.01)。AG治療組與肺損傷組相比T-NOS和NOS活性明顯降低，NO含量也顯著減少(P<0.01)。而cNOS活性無明顯改變。 3 在大鼠急性肺損傷后肺臟線粒體腫脹，表現(xiàn)為A<,540nm>值降低(P<0.01)；線粒體活力下降，A<,570nm>值降低(P<0.01)；膜流動(dòng)性降低，η值變大(P<0.01)。AG治療組與肺損傷組相比，線粒體腫脹降低、膜流動(dòng)性增強(qiáng)、線粒體活力提高(P<0.01)。4電

10、鏡結(jié)果顯示急性肺損傷后肺泡Ⅱ型細(xì)胞水腫，線粒體腫脹、嵴斷裂、溶解、消失；AG能明顯改善急性肺損傷引起的肺泡Ⅱ型細(xì)胞水腫、線粒體腫脹和空泡化。 結(jié)論：AG能明顯抑制急性肺損傷后線粒體中iNOS活性的增加，顯著減少NO的生成，改善線粒體能量供應(yīng)，增加線粒體抗氧化作用，從而減輕急性肺損傷。 第三部分N<'G>-硝基.L-精氨酸對(duì)內(nèi)毒素所致 急性肺損傷大鼠肺臟線粒體的影響 目的：觀察非選擇性一氧化氮合酶抑制劑N

11、<'G>-硝基-L-精氨酸(N<'u>-Nitro-L-Arginine，L-NA)對(duì)急性肺損傷大鼠肺臟線粒體功能的影響，并探討其改善急性肺損傷的作用機(jī)制。 方法：將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組8只)：①空白對(duì)照組；②LPS模型損傷組；③LPS+L-NA治療組?？瞻讓?duì)照組大鼠經(jīng)舌靜脈注射生理鹽水其余各組注射LPS，3小時(shí)后空白組與模型組腹腔注射生理鹽水而LPS+L-NA組腹腔注射L-NA治療。給藥觀察3小時(shí)后，斷頭放血處

12、死大鼠，迅速取出肺組織，勻漿器混勻后，低溫差速離心法提取肺臟組織線粒體，測(cè)定線粒體總ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總一氧化氮合酶(T-NOS)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)的活性，以及線粒體腫脹度、膜流動(dòng)性和線粒體一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量；電鏡觀察大鼠肺臟組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變及治療藥對(duì)此變化的影響。 結(jié)果： 1 在大鼠急性肺損傷

13、后肺臟線粒體總ATP酶、SOD、GSH-Px活性均明顯下降(P<0.01)，線粒體MDA含量明顯升高(P<0.01)。L-NA治療組與肺損傷組相比總ATP酶、SOD、GSH-Px活性均顯著升高(P<0.01)，MDA含量明顯下降(P<0.01)。 2 在大鼠急性肺損傷后肺臟線粒體中的T-NOS和iNOS活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，NO含量也隨之顯著增多(P<0.01)，而cNOS活性無明顯改變。L-NA治療組與肺損

14、傷組相比，T-NOS和iNOS活性明顯降低，同時(shí)cNOS活性也有所降低，N0含量也顯著減少(P<0.01)。 3 在大鼠急性肺損傷后肺臟線粒體腫脹，表現(xiàn)為A<,540nm>值降低(P<0.01)；線粒體活力下降，A<,570nm>值降低(P