腸易激綜合征神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡失控分子機制的研究.pdf

1、研究背景和目的 腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一種常見的消化道功能性疾病，其病理生理機制始終未被完全闡明。應用以往提出的腸道運動異常機制、內(nèi)臟感覺過敏機制、腦腸作用機制、免疫機制等均難以全面解釋IBS的發(fā)病機制。近年來對于IBS發(fā)病機制的研究逐漸深入到分子水平，認為IBS的發(fā)生可能具有其分子異常的改變。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)腸道具有“自己”的神經(jīng)系統(tǒng)(Entericnervous syst

2、em，ENS)、又有機體最大的免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，目前認為腸道的神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等是一個網(wǎng)絡調控的整體，近來有人提出IBS“可塑性”發(fā)病機制的概念，而網(wǎng)絡調控即可能是“可塑性”調控的物質基礎，IBS很可能是這個網(wǎng)絡調控失常所引起，而胃腸激素、免疫細胞因子、細胞受體、離子通道、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等可能作為這個網(wǎng)絡調控的中間介質或不同“環(huán)節(jié)”，在IBS的發(fā)病機制中發(fā)揮一定的作用，并且認為這些生

3、物活性物質或受體可能是IBS發(fā)病的分子生物學基礎。那么，在這個網(wǎng)絡調控中什么分子是關鍵分子，如何進行分子調控將是很有興趣的問題，可能是今后研究IBS發(fā)病機制的重要內(nèi)容。為了驗證這一新的概念，本研究針對幾個難以解釋的IBS臨床常見現(xiàn)象以及尚不明確的IBS發(fā)生機制，檢測此網(wǎng)絡中的幾個重要分子，以探討其在IBS發(fā)生中的作用。 材料和方法 1．32例女性腹瀉型IBS患者(diarrhea predominant：IBS，d-IB

4、S)和21例女性健康對照者參與本研究。首先于空腹狀態(tài)下采集靜脈血，應用高效液相色譜檢測方法測定受試者去除血小板的血漿中5-HT/5-HIAA(5-hydroxyindole aceticacid)濃度；其次，測定受試者飲220ml 37℃溫水及飲同樣體積4℃冷水后30，60，90，120，150，180分鐘的血漿5-HT/5-HIAA濃度。同時問卷調查所有受試者腹痛/腹部不適、腹脹、腹瀉等癥狀的發(fā)生情況，并對其嚴重程度進行評分。

5、 2．根據(jù)羅馬Ⅱ診斷標準選擇50例腹瀉型IBS患者作為研究組，健康志愿者20例作為對照組。按既往有無進冷食冷飲后癥狀出現(xiàn)或加重的病史，將腹瀉型IBS患者分為有對冷刺激敏感史及無對冷刺激敏感史兩組；所有受試者行胃鏡檢查，鏡下鉗取胃竇黏膜-70℃保存?zhèn)溆?；應?-HT單克隆抗體標記EC細胞，應用ANKTMl單克隆抗體標記冷敏感溫度受體，免疫熒光組織化學方法檢測EC細胞和．ANKTMl在腹瀉型IBS患者和健康對照者胃黏膜的表達及分布情況。應用

6、熒光實時定量RT-PCR方法檢測胃黏膜TRPM8、ANKTMl的mRNA表達； 3．根據(jù)功能性胃腸病的羅馬Ⅱ診斷標準，選取IBS患者37例，F(xiàn)D(functionaldyspepsia)患者28例，其均為山東大學齊魯醫(yī)院消化科門診病人，同時征募健康志愿者20例加入本研究。采集空腹靜脈血，用ELISA方法定量測定受試者血清中牛肉、雞肉、鱈魚、玉米、螃蟹、雞蛋、蘑菇、牛奶、豬肉、大米、蝦、大豆、西紅柿和小麥等14種食物抗原特異性Ig

7、G抗體水平以及血清總IgE水平，定性測定受試者血清中上述食物抗原特異性IgE抗體水平。另外，對所有入選患者進行了問卷調查及癥狀評分。評價IBS和FD患者癥狀輕重與升高的食物抗原特異性IgG抗體水平之間的相關性。 4．應用免疫熒光組織化學檢測奶脂球表皮生長因子8(milk fat globule-EGFfactor 8，MFG-E8)在腸黏膜巨噬細胞的表達；其次，應用一個經(jīng)典的體外腸上皮細胞(IEC-18)損傷與修復模型，探討MF

8、G-E8對IEC-18細胞移行及損傷修復的影響及其作用機制：利用腸黏膜炎癥損傷的動物模型進行在體實驗，探討MFG-E8蛋白在腸黏膜表達水平的改變及其對腸上皮細胞增殖、移行以及損傷修復的影響；分別應用重組MFG-E8蛋白以及MFG-E8單克隆抗體干預實驗小鼠，觀察腸上皮細胞的增殖、移行以及損傷修復的改變。 結果 1．空腹狀態(tài)下，腹瀉型IBS患者和健康對照者的血漿5-HT/5-HI從無顯著性差異；飲冰水后30，60，90，1

9、20，150分鐘IBS患者血漿5-HT/5-HIAA濃度顯著升高，5-HT代謝率(5-HIAA：5-HT)無明顯變化，5-HT及5-HIAA峰值以及曲線下面積亦明顯升高。飲溫水未能引起上述結果。另外，飲冰水后19例IBS患者出現(xiàn)腹痛/腹部不適、腹脹、排便急迫感和/或腹瀉等癥狀，有癥狀的IBS患者的血漿5-HT濃度較未發(fā)生癥狀的患者明顯升高，且其5-HT濃度與癥狀輕重呈正相關。 2．研究發(fā)現(xiàn)，d-IBS患者胃黏膜5-HT陽性細胞

10、數(shù)目以及ANKTM1表達較健康對照組明顯升高，既往有冷食、冷飲不耐受病史(冷食+)的d-IBS患者胃黏膜5-HT陽性細胞數(shù)目以及ANKTM1表達較無此病史IBS患者(冷食一)明顯增多；在腹瀉型IBS患者和對照者胃黏膜標本中均檢測到了冷敏感溫度受體TRPM8、ANKTM1的mRNA表達，熒光實時定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)其表達在不同個體存在差異；對冷食、冷飲敏感的IBS患者胃黏膜冷敏感溫度受體ANKTM1表達較無冷食、冷飲敏感史的IBS患者

11、以及健康對照者明顯增高；冷敏感溫度受體TRPM8基因表達有增高趨勢，但無統(tǒng)計學意義。 3．與健康對照組相比，IBS患者血清中螃蟹(p=0.000)、雞蛋(p=0.000)、蝦(p=0.000)、大豆(p=0.017)和小麥(p=0.004)抗原特異性IgG明顯升高，F(xiàn)D患者的血清雞蛋(p=0.000)和大豆(p=0.017)抗原特異性IgG顯著升高。與FD患者相比，IBS患者血清中螃蟹、雞蛋、蝦和小麥抗原特異性IgG顯著升高。食

12、物抗原特異性IgE陽性率在IBS、FD和對照組之間無顯著差異(p=0．971)，血清總IgE抗體滴度在三組受試者之間亦無顯著差異(p=0．978)。最后，癥狀評分與血清食物抗原特異性IgG水平的相關性研究表明，IBS和FD患者癥狀輕重與血清食物抗原特異性IgG水平未見顯著相關性。 4．免疫熒光染色顯示MFG-E8存在于小腸上皮黏膜固有層巨噬細胞胞漿中。在體外IEC-18細胞損傷修復模型中，MFG-E8干預顯著促進細胞移行與修復，

13、并呈劑量依賴性。PKC抑制劑可阻斷上述作用，提示MFG-E8經(jīng)由PKC信號通路發(fā)揮作用。MFG-E8促進細胞移行及修復的機制在于其可結合于損傷邊緣移行細胞膜暴露的磷脂酰絲氨酸結構，改變細胞骨架結構及形態(tài)，使之利于向前移動、爬行。在體實驗表明，在腸黏膜炎癥損傷的實驗動物模型中，MFG-E8蛋白表達下降，同時腸上皮細胞向腸絨毛頂端移行速度減慢。給與實驗動物重組MFG-E8蛋白可促進腸上皮細胞移行及修復。而MFG-E8單克隆抗體腹腔注射以及M

14、FG-E8基因敲除可明顯減緩新生腸上皮細胞向絨毛頂部的移行，因而影響上皮細胞的更新與修復。 結論 1．女性腹瀉型IBS患者進食冷食、冷飲后的癥狀加劇與血漿5-HT水平升高有關。 2．胃黏膜冷敏感溫度受體TRPM8、ANKTMl表達高低和胃黏膜EC細胞數(shù)目的多少可能導致IBS患者與健康對照者對冷食、冷飲刺激的敏感性的不同。攝入冷食、冷飲對胃黏膜造成的冷刺激可能通過激活胃黏膜的冷敏感溫度受體ANKTM1和/或TRPM

15、8，直接或間接導致EC細胞活化釋放神經(jīng)遞質，從而改變腸道的感覺、運動及分泌并引起癥狀的發(fā)生及加重。 3．本研究中IBS與FD患者顯著升高的血清食物抗原特異性IgG水平提示，食物引起的過敏反應與IgG而非IgE升高有關，這種IgG介導的胃腸道對某些食物的過敏反應可能為某些功能性胃腸病潛在的發(fā)病機制之一。因此，飲食中避免特殊過敏食物、研發(fā)低抗原性食物以及免疫調節(jié)治療可能會成為上述功能性胃腸病的未來治療手段之一。 4．研究提示

16、，MFG-E8是腸上皮巨噬細胞分泌的一種與腸黏膜損傷修復緊密相關的蛋白質。MFG-E8水平降低可能為某些胃腸黏膜炎性損傷疾病潛在的發(fā)病機制之一，而且本研究中重組MFG-E8蛋白所顯示的促進腸黏膜損傷修復的作用，為上述疾病提供了新的治療策略。 意義 本研究從腸道的神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡切入，探討此網(wǎng)絡調控中關鍵分子如胃腸激素、免疫細胞因子、細胞受體、離子通道、5-HT等與IBS發(fā)病的關系，尋找IBS發(fā)病的物質基礎，從分子水