動脈粥樣硬化兔血管平滑肌細(xì)胞鈣激活鉀通道活性和α亞單位表達(dá)的變化.pdf

1、目的：研究動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)時(shí)血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(bigconductanceCa2+-activatedK+-channel，BKca)活性和α亞單位表達(dá)的變化及意義。 方法：1.AS模型的建立：選用3月齡新西蘭兔20只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組20只。實(shí)驗(yàn)組飼喂高脂飼料(含0.5％膽固醇+5％豬油+15％蛋

2、黃粉+79.5％普通飼料)，3周后去掉膽固醇；對照組僅飼喂普通飼料，建模時(shí)間共12周。2.AS模型的鑒定：喂養(yǎng)12周的兔模型經(jīng)麻醉和抗凝處理后開胸，有動脈粥樣硬化斑塊病變的胸主動脈組織分別經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋，切片HE染色行光鏡和經(jīng)戊二醛、鋨酸固定，丙酮脫水，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗，618環(huán)氧樹脂包埋，切片醋酸鈾和硝酸鉛染色行電鏡觀察，對建立的AS模型進(jìn)行鑒定。3.膜片鉗實(shí)驗(yàn)：(1)急性酶分離獲取單個(gè)主動脈平滑肌細(xì)胞：將胸主動脈

3、小條置于細(xì)胞分離液中，進(jìn)行37℃恒溫水浴振蕩20～30分鐘，使細(xì)胞間質(zhì)及周圍的連接組織盡量被酶消化，然后將被充分消化后的主動脈組織放于盛有無鈣臺式液的小玻璃瓶中，以該液洗滌兩次，再用尖端光滑的吸管輕輕吹打，以使單個(gè)平滑肌細(xì)胞盡可能游離于無鈣臺式液中，然后用吸管吸出滴于鋪在玻璃培養(yǎng)皿中的小載玻片上，放于4℃冰箱中靜置2～4小時(shí)備用；(2)膜片鉗步驟：將特制的毛細(xì)玻璃管固定于PP-83微電極拉制器上，拉制成尖端內(nèi)徑約1um，充灌電極液后其阻

4、抗約5～8MO的微電極。室溫下采用cell-attached和inside-out膜片鉗單通道技術(shù)進(jìn)行記錄。將分離所得的平滑肌細(xì)胞放于盛有浴液2ml的浴槽內(nèi)，在倒置相差顯微鏡下選擇符合要求的單個(gè)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)電極尖端與細(xì)胞膜表面形成高阻封接時(shí)，即已形成cell-attachedpatch；然后將電極提出液面，空氣中暴露2～3秒，再迅速放回浴液中，形成inside-outpatch。分別記錄AS組和對照組VSMCBKca開放概率(

5、Po)，平均關(guān)閉時(shí)間(Tc)，平均開放時(shí)間(To)和電流幅值(Am)，并對Am的全點(diǎn)直方圖進(jìn)行函數(shù)擬合。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：分析BKcaα亞單位編碼基因KCMA1的mRNA表達(dá)水平。Trizol試劑提取各組胸主動脈平滑肌細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定OD260/OD280的比值，計(jì)算出各組總RNA的濃度與純度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)和隨機(jī)引物

6、將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別根據(jù)從GeneBank數(shù)據(jù)庫中檢索到的兔KCMA1基因(AF321818)和兔GAPDH基因(L23961)mRNA的RefSeq序列設(shè)計(jì)基因特異性引物和探針，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行體外擴(kuò)增cDNA。將KCMA1基因cDNA和兔磷酸甘油醛脫氫酶(g1ucera1dehydephosphatedehydrogenase，GAPDH)基因cDNA梯度稀釋制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各個(gè)樣本循環(huán)指數(shù)增長期的起始

7、點(diǎn)即循環(huán)閾值(cyclethreshold，Ct)和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率值計(jì)算各樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值，以GAPDH基因作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化，統(tǒng)計(jì)分析相同標(biāo)化條件下各組樣本起始模板cDNA是否存在差異，并由此分析各組樣本KCMA1基因表達(dá)的mRNA是否存在差異。 結(jié)果：(1)飼喂12周后鏡檢(HE染色)示對照組的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)膜無增厚，無明顯增殖及脂質(zhì)沉積。AS組粥樣化病灶形成和泡沫細(xì)胞堆積，管壁增厚，證實(shí)造模成功。(2)

8、兔主動脈平滑肌BKca開放具有明顯的電壓和Ca2+依賴性，其電導(dǎo)值大。(3)在cell-attachedpatches(膜電位+40mv)下，AS組和對照組的平均關(guān)閉時(shí)間(CloseTime，Tc)分別為24.257±5.836ms和250.398±17.996ms(p＜0.01，n=10)，開放概率(OpenProbability,Po)分別為0.255±0.054和0.035±0.006(p＜0.01，n=10)。在inside-o

9、utpatch下，二者的Tc為54.390±5.852ms和440.485±36.046ms(p＜0.01,n=10)，Po為0.171±0.038和0.019±0.007(p＜0.01，n=10)。因此，在這兩種膜片下，AS組BKca的Tc顯著縮短，Po顯著增加。(4)RNA的OD260/OD280的比值為1.89±0.11。1.5％瓊脂糖凝膠電泳28s18s條帶清晰可見，28s寬度是18s的2倍，無明顯降解，無DNA污染條帶，表明提