冠心病血栓形成相關(guān)標(biāo)志物的初步研究.pdf

1、第一部分、冠心病血栓形成相關(guān)生化標(biāo)志物研究。 目的：凝血、抗凝、纖溶及內(nèi)皮功能異常與冠心病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死發(fā)生之前可以檢測到患者體內(nèi)的高凝狀態(tài)。單個(gè)研究較少涉及對多個(gè)血栓相關(guān)指標(biāo)的探討，因此，本研究的目的是評估多個(gè)血栓形成相關(guān)因子及一些其它危險(xiǎn)因素對冠心病的影響。 方法：冠心病組共56例，包括26例穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）及30例急性冠脈綜合征（a

2、cute coronary syndrome，ACS）患者，均為2006年1月至7月在武漢協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科住院的患者；對照組54例，均為同期在該院其它科室住院的患者，排除了血栓栓塞性疾病、糖尿病、高血壓病、惡性腫瘤、急慢性肝腎疾病及結(jié)締組織病。病例組和對照組在年齡、性別及樣本采集時(shí)間上均匹配。蛋白C（protein C，PC）、游離蛋白S（free protein S，F(xiàn)PS）、總蛋白S（total protein S，TPS）、凝血酶調(diào)

3、節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）、活化凝血因子VII（activated factor VII，F(xiàn)VIIa）、凝血因子VII抗原（factor VII Antigen，F(xiàn)VIIag）、P選擇素、組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，tPA）及纖溶酶原激活劑抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的血漿水平均采用酶聯(lián)免疫吸附

4、法測定，組織因子活性（tissue factor activity，TFc）采用發(fā)色底物法測定，活化蛋白C（activated protein C，APC）比率、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)bg）、D二聚體（D-dimmer，DD）及凝血酶時(shí)間（thrombin t

5、ime，TT）采用全自動血凝分析儀（Sysmex CA-7000，日本）檢測。血脂水平由協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科統(tǒng)一測定（全自動生化分析儀7170A，Hitachi，日本）。 結(jié)果：ACS組中TFc高于SAP組（P＜0.05）和對照組（P＜0.01）；ACS組中FVIIag水平明顯高于對照組（P＜0.05）；ACS組和SAP組中的FVIIa（P＜0.01）、TM（P＜0.05）及APC比率＜2.4的陽性率（P＜0.01）均明顯高于對照組，

6、APC比率均明顯低于對照組（P＜0.01）；蛋白C、游離蛋白S、總蛋白S、P選擇素、tPA、PAI-1血漿水平及APC抵抗陽性率在各組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Logistic回歸分析顯示，F(xiàn)VIIa及TFc的水平增高是冠心病的危險(xiǎn)因素，高密度脂蛋白和APC比率增高是冠心病的保護(hù)性因素。 結(jié)論：SAP和ACS患者均可出現(xiàn)外源性凝血途徑的激活、對APC反應(yīng)性的下降以及內(nèi)皮功能的受損或活化；血漿中TFc增強(qiáng)可能預(yù)示了急性冠脈事件的發(fā)生；血漿

7、FVIIa及TFc與冠心病的發(fā)病明顯相關(guān)。 第二部分、冠心病血栓形成相關(guān)蛋白標(biāo)志物研究。 目的：利用表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（SELDI-TOF-MS）及弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片CM10檢測急性心肌梗死患者和對照者血漿中蛋白質(zhì)指紋圖譜，篩選出不同組之間的差異蛋白質(zhì)標(biāo)志物并建立相應(yīng)的診斷模型。 方法：急性心肌梗死組77例，均為2006年1月～7月在武漢協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科住院患者，急性腦梗死組32例，為同期在該

8、院神經(jīng)內(nèi)科住院患者，正常對照組60例。病例組和對照組在年齡、性別及樣本采集時(shí)間上均匹配。將受試者血漿與CM10蛋白質(zhì)芯片結(jié)合后，置入SELDI-TOF-MS系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜測定，采用浙江大學(xué)腫瘤中心蛋白芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出差異蛋白質(zhì)并建立相應(yīng)診斷模型。 結(jié)果：用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選出由5個(gè)有顯著差異的蛋白質(zhì)峰（質(zhì)荷比分別為3321.6、16099.3、8058.7、15933.0和16286.7）組

9、合構(gòu)建的診斷模型，區(qū)分急性心肌梗死患者和正常人的診斷特異性和靈敏度分別為95％和88.3％；篩選出由17個(gè)蛋白質(zhì)峰（質(zhì)荷比分別為6682.6、6485.6、3321.6、16682.9、16297.7、7977.5、3424.7、4821.1、11748.7、4775.3、8977.3、9094.8、4361.4、11479.9、2941.1、11399.7和2462.3）組合構(gòu)建的診斷模型，區(qū)分急性心肌梗死者和急性腦梗死者的診斷特異性

10、和靈敏度均為100％。 結(jié)論：SELDI-TOF-MS技術(shù)在急性心肌梗死的診斷上具有較高靈敏度和特異性，發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)峰可能對急性心肌梗死的早期診斷具有一定價(jià)值。 第三部分、MASA技術(shù)檢測冠心病血栓形成相關(guān)基因變化。 目的：冠心病是一種多因素疾病，遺傳因素也參與其發(fā)生和發(fā)展。本研究擬采用液相基因芯片技術(shù)（MASA）檢測急性心肌梗死患者的7種基因多態(tài)性，并對陽性結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，探討MASA技術(shù)檢測基因變化的有效性。

11、 方法：一共有34例急性心肌梗死患者納入研究，均為2006年1月～7月在武漢協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科住院患者。從血液中提取患者DNA并經(jīng)PCR擴(kuò)增，把針對7種基因改變（包括FV Leiden G/A突變、Fbg Beta -455 G/A突變、Fbg Beta -148 C/T突變、Fbg Beta 448 G/A突變、FVII －323 10bp插入突變、凝血酶原20210 G/A突變、MTHFR 677 C/T突變）的核酸探針以共價(jià)方式

12、結(jié)合到特定熒光編碼的微球上，把針對不同檢測物的微球混合，加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交并標(biāo)記熒光物質(zhì)，利用Luminex 100? 多功能流式點(diǎn)陣儀進(jìn)行檢測，采用Sanger雙脫氧鏈中止法對陽性結(jié)果進(jìn)行測序驗(yàn)證。 結(jié)果：34例患者的MASA檢測結(jié)果示，有19例存在基因變化，包括FV Leiden突變4例，MTHFR 677 C/T突變14例，纖維蛋白原β鏈448 G/A突變（Fbgβ448 G/A）5例，其中2例FV Leiden分別合

13、并Fbgβ448 G/A突變和MTHFR677 C/T突變，2例MTHFR 677 C/T突變合并Fbgβ448 G/A突變。陽性結(jié)果經(jīng)測序之后，證實(shí)一共15例患者存在基因變化，F(xiàn)V Leiden僅有1例突變，MTHFR 677 C/T突變12例，F(xiàn)bgβ448 G/A突變4例，其中1例FV Leiden合并Fbgβ448 G/A突變，1例MTHFR 677 C/T突變合并Fbgβ448 G/A突變，MASA檢測的陽性病例的總體正確率為