創(chuàng)新藥物西那沙星與生物大分子的相互作用機(jī)制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸(DNA)是組成生命重要的生物大分子,具有各自的生物功能,對(duì)一切生命現(xiàn)象都起著至關(guān)重要的作用。在分子水平上闡明這些生物大分子與小分子、離子,特別是藥物分子的相互作用,是當(dāng)前生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及化學(xué)等眾多領(lǐng)域的重要研究課題,引起了許多學(xué)者的關(guān)注。建立藥物-生物大分子結(jié)合的體外模型,了解結(jié)合的模式、程度、結(jié)合部位、結(jié)合力等問題,不僅有助于在分子層次的水平上認(rèn)識(shí)生物大分子與小分子的作用機(jī)理和規(guī)律,了解大分子結(jié)構(gòu)與功能

2、的關(guān)系,為生命科學(xué)研究提供有用的信息和數(shù)據(jù),而且有助于認(rèn)識(shí)藥物藥效作用的藥理、毒物毒性作用的毒理之微觀機(jī)制,為藥物分子的設(shè)計(jì)與篩選及新藥的開發(fā)提供有益的啟發(fā)與重要指導(dǎo),其中以蛋白質(zhì)為作用靶和以核酸為作用靶的藥物設(shè)計(jì)正是目前藥物化學(xué)和生命科學(xué)的前沿研究課題。此外,這方面研究的許多成果還應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和生命科學(xué)中的生物大分子分離檢測(cè)。 光譜法尤其是熒光光譜法是研究生物大分子與小分子、離子相互作用的重要手段。熒光測(cè)試中的發(fā)射峰特征

3、、能量轉(zhuǎn)移(即發(fā)生了熒光的加強(qiáng)或猝滅)等指標(biāo)可以對(duì)分子中熒光生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及其所處的微環(huán)境提供有用的信息。在生物大分子與有機(jī)小分子作用機(jī)理的研究中可以引入外源性熒光作為指示探針,也可利用大分子自身的內(nèi)源性熒光作為探針(蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在,使其具有內(nèi)源熒光)。紫外-可見光譜法也是研究藥物分子與生物分子相互作用機(jī)理常用的技術(shù),因?yàn)橛行┧幬锓肿优c生物大分子結(jié)合后,它們的吸收光譜會(huì)有一定的改變,出現(xiàn)吸收峰位移或譜峰寬度變化。

4、蛋白質(zhì)中的某些芳香氨基酸如色氨酸、苯丙氨酸等在紫外區(qū)存在吸收峰,當(dāng)所處的環(huán)境發(fā)生變化時(shí),其紫外吸收光譜隨之發(fā)生變化：吸收峰紅移或者藍(lán)移,吸光度及譜帶亦有變化。DNA分子由于含有堿基生色團(tuán)的雙螺旋結(jié)構(gòu),在260nm附近處有強(qiáng)吸收,可根據(jù)相互作用前后DNA或其靶向分子的吸收譜帶的變化對(duì)二者相互作用模式進(jìn)行判斷。因此,利用光譜方法通過蛋白質(zhì)和DNA分子結(jié)合藥物分子后結(jié)構(gòu)上的變化來研究結(jié)合機(jī)理,是非常有效、簡(jiǎn)便且應(yīng)用最廣泛的方法。 喹諾

5、酮類藥物以其高效、廣譜、服用方便等優(yōu)點(diǎn)在臨床上發(fā)揮了越來越重要的作用。但是,因?yàn)槿源嬖谝幌盗腥秉c(diǎn),有關(guān)其藥效作用機(jī)理、毒副作用等方面還需不斷深入研究,開發(fā)高活性、低副作用的新型喹諾酮類藥物也一直是研究熱點(diǎn)。西那沙星(sinafloxacin)是我國(guó)自主研發(fā)的第四代喹諾酮類抗感染新藥,其作用機(jī)理是通過抑制細(xì)菌DNA促旋酶和Ⅳ的活性,從而抑制細(xì)菌DNA的合成,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。母核的7位具有氮雜螺環(huán)結(jié)構(gòu),擴(kuò)大了抗菌譜、增強(qiáng)了抗菌活性,尤其對(duì)鹽酸

6、環(huán)丙沙星耐藥金葡球菌、表葡球菌、大腸埃希菌等抗菌活力強(qiáng),且細(xì)胞毒性顯著低于同類產(chǎn)品中的加替沙星和左氧氟沙星,8位上的甲氧基能提高其光穩(wěn)定性,減少光解產(chǎn)物帶來的不良反應(yīng),為臨床抗感染治療提供了新的選擇。為了探討西那沙星的生物體內(nèi)作用機(jī)制,本論文研究了西那沙星與生物大分子的相互作用,主要包括以下兩大部分: 第一部分以牛血清白蛋白(BSA)為研究對(duì)象,利用西那沙星對(duì)蛋白質(zhì)分子的熒光具有猝滅作用這個(gè)特征,用熒光光譜和紫外光譜相結(jié)合的方法

7、對(duì)BSA與西那沙星相互作用的機(jī)理進(jìn)行了探討。西那沙星能使BSA的內(nèi)源熒光產(chǎn)生規(guī)律性的猝滅,根據(jù)Stcm-Volmer方程,西那沙星對(duì)BSA的猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)于生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1,且隨溫度升高,Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv減??；紫外光譜亦顯示BSA吸收峰發(fā)生了明顯的紅移(△λ=8nm),因此其熒光猝滅機(jī)制屬于因復(fù)合物的形成而引起的靜態(tài)猝滅。利用熒光猝滅Li

8、neweaver-Burk雙倒數(shù)方程計(jì)算了不同溫度與pH條件下西那沙星與BSA之間的結(jié)合常數(shù)KD,基于Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論分別將一定濃度BSA的熒光光譜數(shù)據(jù)和與BSA等物質(zhì)的量的西那沙星的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)輸入Matlab軟件,測(cè)定計(jì)算了兩者之間的結(jié)合距離r和能量轉(zhuǎn)移效率E。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)由于△G<0,結(jié)合反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行,△S均為正值、△H均為負(fù)值確定了西那沙星與牛血清白蛋白之間的主要作用力類型為靜電作用力,采用同步熒光、三

9、維熒光技術(shù)考察了西那沙星對(duì)BSA構(gòu)象的影響,結(jié)果顯示色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)略有藍(lán)移,表明其所處環(huán)境的疏水性增加,從而揭示藥物分子不僅可以和蛋白質(zhì)分子結(jié)合,而且對(duì)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象都有-定的影響,使BSA形成一種新的無序結(jié)構(gòu)。生物體內(nèi)含有多種金屬元素,它們不僅參與許多重要的生命過程,而且能與喹諾酮藥物發(fā)生配位作用形成配合物,也可與蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生結(jié)合反應(yīng),成為相互作用研究的一個(gè)重要方面。為此,本文還進(jìn)一步考察了金屬離子(Cu2+,F

10、e3+,Zn2+,Mg2+)對(duì)西那沙星-BSA間結(jié)合的影響。研究表明,在金屬離子存在的情況下,減小了藥物與蛋白質(zhì)間的結(jié)合常數(shù),縮短了藥物在血漿中的潴留時(shí)間,增大了藥物的最大作用強(qiáng)度,這對(duì)希望短期提高藥效的臨床治療有一定的作用。 第二部分以小牛胸腺DNA為研究對(duì)象,采用光譜檢測(cè)技術(shù),結(jié)合離子強(qiáng)度考察、單雙鏈DNA實(shí)驗(yàn)、偏振實(shí)驗(yàn)、KI猝滅實(shí)驗(yàn)、DNA熱變性實(shí)驗(yàn)、粘度法等多種方法研究了西那沙星與DNA之間的相互作用模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,

11、加入DNA后西那沙星紫外吸收峰位置并未出現(xiàn)明顯紅移,Stern-Volmer方程計(jì)算熒光猝滅常數(shù)Ksv隨溫度增加而降低;隨著以Na+表征的離子強(qiáng)度的增加,DNA對(duì)西那沙星的熒光猝滅程度變化甚小,說明西那沙星與DNA之間不存在非特異性的靜電作用；單鏈DNA(ssDNA)對(duì)西那沙星的猝滅作用略大于雙鏈DNA(dsDNA);不同DNA濃度時(shí),西那沙星的熒光偏振值沒有明顯改變；KI猝滅數(shù)據(jù)顯示西那沙星并未受到DNA堿基對(duì)的有效保護(hù),DNA熱變性