藤茶中黃酮、二氫楊梅素的提取分離、降血脂作用及藤茶安全評價的研究.pdf

1、藤茶為我國特有茶用、藥用植物,富含二氫楊梅素等黃酮類物質(zhì)。有關藤茶的研究主要集中在藤茶活性成分的分離鑒定及黃酮抗菌、抗氧化、降血糖作用等方面。本文在對藤茶飲用的安全性進行評價的基礎上,以活性為跟蹤,采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設計法研究了藤茶主要活性成分黃酮及二氫楊梅素的提取條件,比較了不同藤茶原料黃酮含量及其活性的變化,篩選了利用大孔樹脂純化藤茶黃酮的分離條件,對藤茶水提物、黃酮及二氫楊梅素的降血脂作用及其機理進行系統(tǒng)研究,以期為藤茶的開發(fā)應

2、用提供理論基礎。
　　 1、藤茶黃酮提取條件的研究
　　 在單因素實驗的基礎上,采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計方法研究了溫度、時間、料液比、乙醇濃度對藤茶黃酮和二氫楊梅素(DHM)提取率、黃酮純度及其對O2.-自由基清除率的影響。結(jié)果表明,溫度、時間、料液比極顯著影響藤茶黃酮及二氫楊梅素的提取率,建立的回歸模型顯著性檢驗達極顯著水平,回歸模型的預測值與實測值能較好地擬和。結(jié)合黃酮的純度和對O2.-自由基清除率活性分析,藤茶

3、黃酮的最佳浸提條件:乙醇濃度在-0.8～1水平(67％～85％),浸提溫度在0～1水平(65℃～77.5℃),浸提時間在-1～0.3水平(60min～100min),料液比在0～1水平(1:30～40)。根據(jù)二氫楊梅素的提取率和含量分析,其最佳提取條件為:提取溫度在-0.8～0.03水平(55℃～65℃),時間在-0.1～0.1水平(86min～93min),料液比在0～0.5水平(1:30～35),乙醇濃度在0.5～0.1水平(74％

4、～80％)。
　　 2、不同藤茶原料黃酮含量及活性的研究
　　 2.1生育期的影響。對藤茶不同嫩度以及新梢不同部位原料的黃酮、二氫楊梅素含量及黃酮清除O2.-自由基的活性進行分析,表明隨著原料的老化,黃酮含量及其清除O2.-自由基的能力呈下降趨勢。二氫楊梅素的變化趨勢與黃酮基本相同。與葉片相比,藤茶梗中黃酮和二氫楊梅素的含量最低,但活性卻相對較高。提示一方面藤茶中的活性黃酮主要集中在葉片,尤其是生育旺盛的部位積累最多,另

5、一方面莖梗與葉片黃酮的組成可能存在較大差異。
　　 2.2栽培條件的影響。分別對栽培型、野生型、仿野生型藤茶的黃酮和二氫楊梅素含量以及清除O2.-自由基的活性進行分析。結(jié)果表明,黃酮和二氫楊梅素含量以及清除O2.-自由基的活性大小依次為野生型>仿野生型)栽培型。提示藤茶生長條件的改變已對體內(nèi)生理生化變化產(chǎn)生了較大影響。
　　 2.3產(chǎn)地的影響。分析了全國主要藤茶產(chǎn)地湖南、湖北、廣東、廣西、江西、福建等地所產(chǎn)藤茶原料中黃酮

6、、二氫楊梅素含量及其活性變化。結(jié)果表明,以廣東連南、福建武平、江西定南所產(chǎn)藤茶的黃酮及二氫楊梅素含量最高,湖南桑植、茶陵、恩施來風所產(chǎn)藤茶的黃酮及二氫楊梅素含量相對較低。各地藤茶黃酮清除O2.-自由基的能力與其含量的相關性不明顯(r=0.2769),但與二氫楊梅素的含量呈極顯著的正相關(r=0.8330)。由此說明,藤茶黃酮的活性主要與其組成有關,而二氫楊梅素是黃酮活性的主體成分。
　　 2.4葉型的影響。對大、中、小三種不同葉

7、型的藤茶黃酮進行分析,表明黃酮和二氫楊梅素含量高低依次為中葉>小葉>大葉,黃酮清除O2.-自由基的活性大小依次為小葉>中葉>大葉,但小葉和中葉型藤茶黃酮的活性變化差異不顯著。說明在進行品種選育時應以中、小葉型藤茶為主。
　　 3、藤茶中黃酮的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　 選用11種大孔樹脂對藤茶黃酮進行了靜態(tài)吸附與解吸附實驗。結(jié)果表明,1號樹脂適宜于藤茶黃酮的分離純化,對黃酮的吸附量可達41.41mg/g,解析率達到89.5

8、％。通過動態(tài)吸附實驗對1號樹脂有關參數(shù)進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,黃酮上樣濃度6-7mg/ml,上樣體積為柱體積的1/3,流速1.8ml/min,用95％的乙醇進行洗脫,可達到較好的洗脫與純化效果,黃酮的洗脫率可達90％左右,洗脫出的黃酮純度達65％左右。進一步利用重結(jié)晶方法得到純度為98.7％的純品,經(jīng)紫外可見光譜,紅外光譜、LC-Ms分析表明,黃酮中的主要成分為二氫楊梅素。
　　 4、藤茶安全性毒理學實驗研究
　　 根據(jù)保

9、健食品檢驗與評價技術規(guī)范對藤茶安全性進行了評價。急性毒性試驗結(jié)果表明,受試藤茶屬無毒級；3項致突變試驗結(jié)果均為陰性。大鼠90天喂養(yǎng)試驗中,藤茶各劑量組動物生長發(fā)育良好,對體重、食物利用率無不良影響。各劑量組血常規(guī)、白細胞分類結(jié)果與對照組無顯著差異。大鼠血清ALT、AST、BUN、TC、TG、CRE、GLU、ALB、TP測定結(jié)果與對照組比較無顯著差異。臟器系數(shù)與對照差異不明顯。肝、心、脾、腎、胃腸、睪丸、卵巢等器官外觀和組織切片與對照相比

10、均未發(fā)現(xiàn)實質(zhì)性病理改變。說明飲用藤茶安全無毒。
　　 5、藤茶提取物降大鼠及人體血脂作用研究
　　 用大鼠脂質(zhì)代謝紊亂模型法研究藤茶提取液對大鼠的降血脂作用。結(jié)果表明,與高脂模型組比較,藤茶高劑量組(4.5g/Kg.bw)大鼠血清TC顯著降低,高、中劑量組(3.0g/Kg.bw)血清TC下降>10％；高、中劑量組TG顯著降低,其中,高劑量組TG下降>15％；高、中、低劑量組(1.5g/Kg.bw)HDL-C顯著升高,其中

11、,高劑量組HDL-C升高值>0.12mmol/L。人體臨床試驗表明,服用藤茶組降TC有效率為42.0％,降TG有效率為72.0％,降血脂有效率為28.0％,極顯著高于對照組。服用藤茶組血清TC、TG明顯降低,與試用前及對照組比較差異極顯著。試驗組實驗前后血液學指標及血生化指標檢驗結(jié)果無顯著變化。提示藤茶提取物對大鼠及人體都有輔助降血脂的作用。
　　 6、藤茶中黃酮及二氫楊梅素降血脂作用研究
　　 對藤茶中主要活性成分黃酮

12、及二氫楊梅素對高血脂癥小鼠的降血脂效果進行了研究。結(jié)果表明,與高脂模型組比較,0.5g/kg.bw灌胃(ig)劑量的二氫楊梅素能明顯減輕小鼠體重；各劑量黃酮都能顯著降低小鼠血清TG含量；0.3g/kg.bw ig劑量二氫楊梅素能顯著降低小鼠血清TC、TG、LDL-C含量,0.5g/kg.bw ig劑量二氫楊梅素能極顯著提高血清HDL-C含量；黃酮及二氫楊梅素都能明顯提高小鼠血清SOD活性,降低血清MDA含量及肝系數(shù)。肝臟病理學觀察表明,

13、藤茶黃酮及二氫楊梅素能降低肝細胞變性、腫脹的程度。說明藤茶黃酮及二氫楊梅素能降低小鼠血脂,增強機體抗氧化能力,減輕高脂對肝細胞的損傷作用。
　　 7、二氫楊梅素發(fā)揮生理活性的機理研究
　　 結(jié)合藥代動力學原理,應用紫外吸收光譜、熒光光譜等方法對二氫楊梅素與牛血清白蛋白(BSA)相互作用機理進行了研究。結(jié)果表明,在弱堿性條件下,二氫楊梅素易解離成為陰離子,紫外吸收峰發(fā)生明顯紅移；在生理pH(7.4)下,BSA中加入不同濃度

14、的二氫楊梅素后,吸收峰發(fā)生了紅移。二氫楊梅素對BSA的內(nèi)源熒光強度有較強的猝滅作用,屬靜態(tài)猝滅類型,猝滅速率常數(shù)Kq=3.97×1012；二氫楊梅素與BSA之間結(jié)合位點數(shù)n=1.97,結(jié)合常數(shù)KA=5.04×109。Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+金屬離子的存在會使二氫楊梅素與BSA的速率猝滅常數(shù)增大,結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)降低,減小了二氫楊梅素與BSA的結(jié)合,而Fe3+使二氫楊梅素與BSA的結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合常數(shù)都增加,提高了二氫楊