HO-1在腹膜透析所致腹膜纖維化中的作用及其機制.pdf

1、目的：構(gòu)建帶有大鼠血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-HO-1和化學(xué)合成HO-1-siRNA，分別以pcDNA3.1-HO-1和HO-1-siRNA體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞（rat peritoneal mesothelial cells,RPMCs），檢測HO-1高表達(dá)和低表達(dá)對高糖作用下RPMCs過氧化損傷及TGF-β1、FN和Smads表達(dá)的影響，研究HO-1

2、在腹膜透析所致腹膜纖維化中的作用及其機制。
　　方法：從SD大鼠脾臟中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA，以cDNA為模板，PCR法擴增大鼠HO-1基因的CDS區(qū)全長片段，PCR產(chǎn)物加“A”尾后連接至pMD-18T克隆載體，KpnⅠ和Bam HI內(nèi)切酶雙酶切pMD-18T-HO-1后獲取HO-1片段，T4DNA連接酶將HO-1片段與KpnⅠ和Bam HI雙酶切后的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)相連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcD

3、NA3.1-HO-1。重組載體pcDNA3.1-HO-1經(jīng)脂質(zhì)體lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)RPMCs，RPMCs分為正常對照組、2.5％高糖組、2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組，孵育6h后更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)液上清,比色法檢測上清MDA、GSH、SOD水平，ELISA檢測TGF-β、FN含量，提取細(xì)胞總RNA及總蛋白，RT-PCR檢測RPMCs中大

4、鼠HO-1mRNA表達(dá)，Western blot檢測RPMCs中大鼠HO-1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)。設(shè)計3對針對大鼠HO-1基因的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA），化學(xué)合成HO-1-siRNAs和陰性對照siRNA，以脂質(zhì)體lipofectamine2000將上述siRNA轉(zhuǎn)染RPMCs，RT-PCR檢測HO-1mRNA表達(dá)，篩選出干擾效率最高的1對HO-1-siRN

5、A進行后續(xù)實驗。RPMCs分為正常對照組、2.5%高糖組、2.5%高糖+HO-1-siRNA轉(zhuǎn)染組、陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后孵育6h，更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)液上清及提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別檢測上清中MDA、GSH、SOD、TGF-β、FN的含量和細(xì)胞中HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)以及p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：成功克隆了SD大鼠HO-1基因，構(gòu)建的pcDNA3.

6、1-HO-1載體經(jīng)PCR擴增、KpnⅠ和Bam HI雙酶切鑒定及測序驗證，重組表達(dá)載體包含大鼠HO-1基因，且堿基序列與GeneBank中收錄的大鼠HO-1序列一致。分離培養(yǎng)原代RPMCs，免疫組化鑒定結(jié)果可見，抗波形蛋白免疫組化染色陽性，而抗Ⅷ因子相關(guān)抗原及抗白細(xì)胞CD45抗體染色陰性，證實分離培養(yǎng)的是RPMCs。pcDNA3.1-HO-1轉(zhuǎn)染RPMCs后檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，2.5%高糖組RPMCs培養(yǎng)上清液中MDA含量明顯升

7、高（P<0.05），而SOD和GSH水平明顯降低（P<0.05）。2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1轉(zhuǎn)染組MDA含量較高糖組明顯降低（P<0.05），而SOD和GSH水平則有明顯升高（P<0.05）?？蛰d體對照組與正常對照組相比，MDA、SOD和GSH水平均無明顯差異（P>0.05）。ELISA檢測結(jié)果表明，與正常對照組相比，2.5%高糖組RPMCs培養(yǎng)上清液中TGF-β1、FN水平明顯升高（P<0.05），2.5%高糖+pcDN

8、A3.1-HO-1轉(zhuǎn)染組TGF-β1、FN水平較高糖組明顯降低（P<0.05）?？蛰d體對照組與正常對照組相比，TGF-β1、FN水平均無明顯差異（P>0.05）。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，與正常對照組相比，2.5%高糖組RPMCs中HO-1mRNA和蛋白表達(dá)量明顯升高（P<0.05），2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1轉(zhuǎn)染組HO-1mRNA和蛋白表達(dá)量較2.5%高糖組有進一步升高（P<0.05）?？蛰d體對

9、照組與正常對照組相比HO-1mRNA和蛋白表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）。與正常對照組相比，2.5%高糖組RPMCs中p-Smad2、p-Smad3、Smad7蛋白表達(dá)量均明顯升高（P<0.05），2.5%高糖+pcDNA3.1-HO-1轉(zhuǎn)染組p-Smad2、p-Smad3蛋白表達(dá)量較2.5%高糖組明顯降低（P<0.05），而Smad7蛋白表達(dá)量降低不明顯（P>0.05），空載體對照組與正常對照組相比p-Smad2、p-Smad3、S

10、mad7蛋白表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）。siRNA干擾效率檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，合成的3對HO-1-siRNA均能可不同程度地抑制RPMCs中HO-1mRNA的表達(dá)（P<0.05），其中HO-1-siRNA2干擾效率最高，而陰性對照siRNA對HO-1mRNA的表達(dá)無明顯影響（P>0.05）。以HO-1-siRNA2轉(zhuǎn)染RPMCs后檢測發(fā)現(xiàn)，與2.5%高糖組相比，2.5%高糖＋HO-1-siRNA轉(zhuǎn)染組HO-1mRNA及蛋白

11、表達(dá)均明顯下降（P<0.05），同時培養(yǎng)液上清中MDA、TGF-β1、FN含量均明顯升高（P<0.05），而SOD和GSH水平則明顯下降（P<0.05），伴有p-Smad2、p-Smad3蛋白表達(dá)升高和Smad7蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組與正常對照組相比以上各項指標(biāo)均無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：成功克隆了大鼠HO-1基因并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HO-1。HO-1基因轉(zhuǎn)染可明顯

12、提高RPMCs中HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)，而HO-1-siRNA干擾可明顯降低RPMCs中HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)。RPMCs中HO-1高表達(dá)可減輕高糖引起的過氧化損傷及致纖維化因子的產(chǎn)生，同時抑制p-Smad2、p-Smad3激活而提高Smad7功能。HO-1低表達(dá)則可加重高糖引起的過氧化損傷及致纖維化因子的產(chǎn)生，并增加p-Smad2、p-Smad3激活而降低Smad7功能。因此，HO-1可通過抗氧化損傷作用起到抑制腹膜纖維化