小鼠腹腔B1細(xì)胞一氧化氮(NO)依賴性殺菌機(jī)制研究.pdf

1、關(guān)于B1細(xì)胞的特性和功能等的研究一直是近10年來免疫學(xué)領(lǐng)域的重要課題。B細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，目前研究認(rèn)為B細(xì)胞至少分為B1和B2兩個細(xì)胞亞群，其中位于腹腔的B1細(xì)胞具有天然免疫細(xì)胞的特性，表達(dá)吞噬相關(guān)表面標(biāo)記Mac-1、F4/80等分子，在抗感染等天然免疫應(yīng)答中具有重要的作用。本實驗組前期實驗工作中發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔B1細(xì)胞可以吞噬金黃葡萄球菌，并具有清除細(xì)菌和真菌感染的作用。專職吞噬細(xì)胞的殺菌機(jī)制有兩方面，其中一方面通過溶酶體

2、內(nèi)的酶來殺滅病原體，另一方面是氧化殺菌機(jī)制，就是通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生NO等氧自由基，來殺滅病原體。關(guān)于小鼠腹腔B1細(xì)胞吞噬殺菌過程中是否存在氧化殺菌機(jī)制尚不清楚，為進(jìn)一步闡釋NO在B1細(xì)胞殺菌過程中的作用，本實驗對其機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　目的：本實驗旨在通過體外實驗取小鼠腹腔B1細(xì)胞與金黃葡萄球菌（SA）共培養(yǎng)，檢測一氧化氮（NO）合成量，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）及相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。觀察經(jīng)氨基胍（AG）體外抑制iN

3、OS功能后細(xì)胞內(nèi)SA的存活率，探討小鼠腹腔B1細(xì)胞殺菌機(jī)制中NO的作用。
　　方法：（1）取C57BL/6小鼠的腹腔灌洗液細(xì)胞及脾臟細(xì)胞，以PE/Cy5-ratantimouseCD19及親和素標(biāo)記的磁珠進(jìn)行免疫磁珠分選，最終得到腹腔CD19+細(xì)胞（B1細(xì)胞）和腹腔CD19-細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）。將磁珠分選得到的細(xì)胞分別行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測磁珠分選效率及與SA共培養(yǎng)，檢測NO合成量的變化；（2）將上述磁珠分選得到的B1細(xì)胞與SA共培養(yǎng)

4、，提取總RNA行RealTime-PCR比較各組iNOS及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)量；（3）將上述磁珠分選得到的B1細(xì)胞與SA共培養(yǎng)，行AG體外抑制iNOS的功能，觀察細(xì)胞內(nèi)SA的存活率。
　　結(jié)果：（1）流式結(jié)果發(fā)現(xiàn)磁珠分選B1細(xì)胞效率較高，B1細(xì)胞與金葡菌共培養(yǎng)后，用硝酸還原酶法檢測，發(fā)現(xiàn)NO的產(chǎn)生量與對照組相比明顯增加，NO合成量與共培養(yǎng)時間成正比例；（2）RealTime-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)SA誘導(dǎo)刺激后不同時間點B1細(xì)胞iN

5、OSmRNA的表達(dá)量明顯升高，IL-4、IL-10的表達(dá)量與對照組相比明顯降低，TNF-α、IFN-γ的表達(dá)量與對照組相比明顯升高；（3）本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)AG體外抑制iNOS功能后，細(xì)胞內(nèi)SA菌的存活率明顯高于未加氨基胍組。
　　結(jié)論：小鼠腹腔B1細(xì)胞體外經(jīng)金黃葡萄球菌誘導(dǎo)刺激后其NO合成量及iNOS表達(dá)量明顯升高，同時IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平發(fā)生明顯改變。經(jīng)氨基胍體外抑制iNOS功