乙肝患者腸道真菌菌群多樣性研究和常見真菌菌種核酸定量分析.pdf

1、[目的]: 腸道真菌群落是人類腸道功能器官的重要組成部分，對于調(diào)節(jié)腸道健康狀態(tài)發(fā)揮重要作用。肝臟與腸道之間存在著密切的解剖及生理學(xué)關(guān)系，肝臟的功能直接影響腸道功能。本研究從分子水平研究不同乙肝狀態(tài)下腸道真菌菌群的分子生態(tài)結(jié)構(gòu)變化，揭示乙肝患者腸道中真菌菌群的多樣性，以及不同乙肝狀態(tài)下腸道真菌的定性、定量關(guān)系，明確真菌菌群結(jié)構(gòu)變化與乙肝發(fā)展歷程的相關(guān)性，探索腸道真菌菌群失衡與腸道內(nèi)源性感染及肝病重癥化的關(guān)系，為進(jìn)一步研究影響肝病進(jìn)

2、程的關(guān)鍵作用機(jī)制，尋找干預(yù)和阻斷肝病重癥化發(fā)展過程的措施奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [方法]: 1.以乙肝肝硬化患者、慢性乙型肝炎患者、HBV攜帶者、和健康志愿者作為研究對象，采用QIAamp()DNA糞便試劑盒-玻璃珠擊打法分別抽提各組研究對象的糞便總DNA，真菌18SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行18SrRNA基因克隆，構(gòu)建真菌18SrDNA克隆文庫，利用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)篩選陽性克隆子并進(jìn)行序列

3、分析，利用MEGA4.0等軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析各組研究對象腸道真菌菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)特征。 2.建立一種準(zhǔn)確、可靠的監(jiān)測腸道真菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，設(shè)計(jì)真菌的種特異性引物，對腸道白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、釀酒酵母等常見真菌進(jìn)行核酸定量分析，比較和分析各組之間各菌種的定量關(guān)系。 [結(jié)果]: 1.四組研究對象所有陽性克隆子經(jīng)過酶切分析和測序，共獲得27個(gè)操作分類單元(OT

4、Us)，歸屬于3個(gè)真菌類群：接合菌綱(3.7％)，子囊菌綱(81.5％)和擔(dān)子菌綱(14.8％)，其中檢出最多的真菌菌屬是念珠菌屬(占克隆子總數(shù)44.7％)、酵母菌屬(占克隆子總數(shù)14.0％)和未培養(yǎng)真菌(占克隆子總數(shù)16.8％)。三組不同乙肝狀態(tài)患者腸道中念珠菌屬和酵母菌屬分布比例高于健康人，而未培養(yǎng)真菌低于健康人。乙肝肝硬化患者組、慢性乙型肝炎患者組、HBV攜帶者組和健康志愿者組的腸道真菌菌落分別存在有18、17、12、13個(gè)OTU

5、s，乙肝肝硬化患者組、慢性乙型肝炎患者組腸道真菌菌群多樣性較高。 2.不同乙肝狀態(tài)患者腸道常見真菌數(shù)量發(fā)生改變，除了近平滑念珠菌之外，其他幾種常見腸道真菌數(shù)量在乙肝肝硬化患者組、慢乙肝患者組、乙肝攜帶者組、健康組之間都存在顯著性差異。其中，乙肝肝硬化患者組白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、釀酒酵母都比健康志愿者組顯著增多(P<0.05)；慢性乙型肝炎患者組白色念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、釀酒酵母比健康志愿者組顯

6、著增多(P<0.05)。 [結(jié)論]: 1.人類腸道中存在較為豐富的真菌類群，不同乙肝狀態(tài)患者腸道真菌菌群多樣性發(fā)生改變，乙肝肝硬化患者組、慢性乙型肝炎患者組腸道真菌菌群多樣性較強(qiáng)，其優(yōu)勢真菌菌屬為念珠菌屬和酵母菌屬，提示腸道真菌菌群結(jié)構(gòu)改變與乙肝發(fā)展歷程相關(guān)。 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速的對人類腸道真菌菌種進(jìn)行核酸定量分析，可以為預(yù)防肝病患者發(fā)生條件致病性真菌感染提供新的檢測和監(jiān)測手段。 3