構(gòu)建能夠特異性檢測和高效吸附水中六價鉻離子的大腸桿菌菌株.pdf

1、目的：
　　通過克隆技術(shù)將真氧產(chǎn)堿桿菌大質(zhì)粒pMOL30上鉻抗性調(diào)節(jié)基因chrB（ChrB是調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)鉻轉(zhuǎn)運蛋白 ChrA的表達）與增強型熒光蛋白基因 mTagbfp2融合，連接到pEASY-Blunt T Zero，以DH5α為宿主菌，構(gòu)建了一株對鉻特異性響應(yīng)的全細胞微生物傳感器；此外，本文利用基因工程技術(shù)將鉻抗性調(diào)節(jié)基因chrB與pET28b質(zhì)粒連接，同時將chrB與蛋白膜表達元件Lpp-OmpA融合后克隆至pET28b載

2、體中，以BL21為宿主菌，構(gòu)建了兩株能有效吸附六價鉻的全細胞微生物除污菌株。以上研究，為微生物在重金屬環(huán)境 Cr（VI）污染的檢測和修復(fù)領(lǐng)域的研究提供了基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建重金屬Cr（VI）全細胞微生物質(zhì)粒型檢測菌株
　　1.1通過PCR擴增技術(shù)從真氧產(chǎn)堿桿菌中擴增得到鉻特異性相應(yīng)蛋白基因chrB和啟動子 PchrA，再通過交叉PCR技術(shù)將 chrBPchrA與增強型型藍色熒光蛋白基因 mTagbfp2和增

3、強型綠色熒光蛋白 egfpmut2基因重組融合，并進一步與 pEASY Blunt T Zero克隆載體連接構(gòu)建以PchrA為單啟動子的質(zhì)粒型報告菌株；
　　1.2兩種熒光蛋白質(zhì)粒型報告菌株的比較通過將兩株菌在LB中長到相同的OD值0.1左右，分裝等體積加入不同濃度的鉻金屬離子進行誘導(dǎo)檢測，觀察這兩種熒光強度對金屬離子濃度依賴性強弱，即熒光強度的高低；
　　1.3增強型藍色熒光蛋白基因 mTagbfp2為報告基因的檢測菌株檢

4、測條件的優(yōu)化及相關(guān)參數(shù)的確定，包括特異性、誘導(dǎo)動力學(xué)實驗，最適檢測范圍的確定
　　1.3.1最佳誘導(dǎo)OD值
　　通過將pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α菌株分別在OD值為0.1、0.2和0.4的時候?qū)ζ溥M行誘導(dǎo)，以查看其熒光強度對不同濃度的金屬鉻離子的依賴性；
　　1.3.2最佳誘導(dǎo)時間將檢測菌株在0.1的誘導(dǎo)起始OD條件下，加入1 mmol/L終濃度的K2CrO4，誘

5、導(dǎo)1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，比較其不同誘導(dǎo)時間下的熒光強度的大??；
　　1.3.3適宜宿主菌的篩選通過將質(zhì)粒pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2導(dǎo)入到經(jīng)冷氯化鈣法制備的野生型MC4100感受態(tài)菌株中，與pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α菌株以相同的條件進行誘導(dǎo)，觀察兩株菌株熒光蛋白表達的強弱；
　　1.3.4不同價態(tài)的鉻對檢

6、測菌株的誘導(dǎo)影響在相同條件下將pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DHα檢測菌經(jīng)過相同系列濃度的KCl3、K2CrO4、K2Cr2O4誘導(dǎo)，觀察其對不同價態(tài)鉻響應(yīng)的濃度依賴性；
　　1.3.5檢測菌株的檢測特異性通過將菌株pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α在100μmol/L濃度下的Cr6+、As3+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、

7、Fe2+、Hg2+、Ni2+和 Co2+進行相同條件的誘導(dǎo)，觀察檢測菌株對 Cr6+離子的響應(yīng)特異性；
　　1.3.6檢測菌株的檢測線性將檢測菌株在0、1.0×10-5、2.0×10-5、4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、1.8×10-4和2.0×10-4 mol/L濃度下進行誘導(dǎo)觀察其對Cr6+的線性范圍。
　　2.構(gòu)建重金屬Cr（VI）全細胞微生物除污菌株
　　2.1通過PCR從構(gòu)建好

8、的質(zhì)粒pBAD-LO-chrB中將chrB和融合基因LO-chrB基因擴增出來，另外，用Nco I和Hind III酶對pET28b質(zhì)粒進行消化，對消化質(zhì)粒進行膠回收，與chrB基因片段和LO-chrB基因進行重組融合，構(gòu)建成兩個除污質(zhì)粒pET28b-chrB和pET28b-LO-chrB,前者是在胞內(nèi)表達除污蛋白chrB，后者是在細菌膜表面表達除污蛋白。
　　2.2除污蛋白chrB和LOchrB的表達將除污菌株在200μmol/

9、L終濃度的IPTG中誘導(dǎo)表達0 h、2 h、6 h、12 h和24 h，收集菌體調(diào)整OD值一致（OD為10的菌上樣量10-15μl），跑SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色觀察除污蛋白隨著誘導(dǎo)時間的延長表達量的變化，另外用Western Blot驗證目的蛋白的表達；2.3通過對胞內(nèi)除污蛋白表達菌株在500 ml LB誘導(dǎo)表達蛋白吸附鉻后進行蛋白純化且用ICP-MS檢測蛋白中結(jié)合的鉻含量；
　　2.4除污菌株Cr（VI）吸附條件的

10、探索分別將除污蛋白膜表達菌株固定鉻濃度采用不同吸附時間以及固定時間采用不同濃度鉻吸附探究除污菌株最佳鉻的吸附時間和濃度；
　　2.5除污菌株的除污性能的比較
　　2.5.1將胞內(nèi)除污蛋白表達菌株與膜表達除污蛋白菌株相同系列鉻濃度的條件下進行鉻吸附量的比較，確定優(yōu)勢吸附菌株。
　　2.5.2將胞內(nèi)除污蛋白表達菌株與膜表達除污蛋白菌株在含有50μmol/L的六價鉻20mmol/L Tris-HCl pH6.8的模擬水樣中進

11、行吸附實驗。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了重金屬Cr（VI）全細胞微生物質(zhì)粒型檢測菌株
　　1.1通過交叉PCR和無縫克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α和pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-egfpmut2/DH5α兩株質(zhì)粒型報告菌株。
　　1.2兩種熒光蛋白質(zhì)粒型報告菌株的比較
　　將兩株菌在相同條件下誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)

12、1×10-3、2.5×10-3和5×10-3 mol/L的K2Cr2O4都能較好地啟動pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-mTagBFP2/DH5α中的mTagBFP2蛋白的表達，而且信號明顯高于pEASY-Blunt T Zero-chrBPchrA-egfpmut2/DH5α的熒光強度。
　　1.3增強型藍色熒光蛋白mTagBFP2為報告分子的檢測菌株檢測條件的優(yōu)化及相關(guān)參數(shù)的確定，包括特異性、誘導(dǎo)動力學(xué)

13、實驗，最適檢測范圍的確定
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)以藍色熒光蛋白基因為報告基因的菌株對鉻（VI）的響應(yīng)能力較強；且該菌株在LB中的最佳誘導(dǎo)OD值為0.1；最佳誘導(dǎo)時間為4 h；該檢測質(zhì)粒在DH5α中的檢測性能優(yōu)于野生型MC4100，CrCl3、K2CrO4、K2Cr2O4均能誘導(dǎo)檢測菌株產(chǎn)生熒光蛋白，且重鉻酸鉀能夠以相對較低的濃度使檢測菌響應(yīng)，但是鉻酸鉀對檢測菌的誘導(dǎo)產(chǎn)生的最大信號最高；CrCl3傳感器的誘導(dǎo)效應(yīng)較弱；檢測菌株能夠?qū)︺t產(chǎn)生特異

14、性響應(yīng)；響應(yīng)線性在20-140μmol/L的范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)為R=0.99243。
　　2.構(gòu)建重金屬Cr（VI）全細胞微生物除污菌株
　　2.1結(jié)果顯示成功構(gòu)建了膜內(nèi)除污蛋白表達菌株和膜上除污蛋白表達菌株；
　　2.2結(jié)果顯示胞內(nèi)和膜上除污蛋白表達菌株的蛋白表達量隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加，WB驗證除污蛋白已成功表達；
　　2.3結(jié)果顯示調(diào)節(jié)蛋白鉻的結(jié)合量為每個蛋白分子結(jié)合1個鉻離子；
　　2.4結(jié)果顯

15、示膜上表達除污蛋白菌株對鉻的吸附量隨著鉻濃度及吸附時間的延長而增加；
　　2.5結(jié)果顯示胞內(nèi)表達除污蛋白菌株對鉻的吸附能力優(yōu)于膜上表達除污蛋白的除污菌株，前者的吸附量約為后者吸附量的3倍。在50μmol/L的六價鉻20mmol/L Tris-HCl pH6.8的模擬水樣中進行吸附的結(jié)果顯示，膜表面表達蛋白的除污菌株的吸附性能高于膜內(nèi)表達蛋白的除污菌株。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建檢測Cr（VI）的pEASY-Blun

16、t T Zero-chrBPchrA-mTagbfp2/DH5α微生物全細胞質(zhì)粒型檢測菌株，其檢測的最適起始OD值為0.1，最佳誘導(dǎo)時間為4 h，能特異性檢測 Cr（VI），檢測線性范圍為20-140μmol/L，線性相關(guān)系數(shù)為R=0.99243。
　　2.成功構(gòu)建了有效吸附鉻的基因工程菌株pET28-chrB/BL21和pET28-LO-chrB/BL21，且菌株對鉻的吸附量能夠隨著調(diào)節(jié)蛋白ChrB誘導(dǎo)表達的增加和吸附時間的延長