人參皂苷Rg1對抗腦缺血再灌注細(xì)胞凋亡及p-JNK表達(dá)的實驗研究.pdf

1、目的：明確人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1調(diào)控JNK及其效應(yīng)分子的表達(dá)、抑制神經(jīng)元凋亡、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機制。
　　 材料與方法：健康SD大鼠（250～300g）隨機分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖俟嘧⒔M（以下簡稱：模型組）、模型+人參皂苷Rg1治療組（以下簡稱：人參皂苷Rg1組）、模型+尼莫地平1mg/kg陽性藥物治療組（以下簡稱：陽性藥物對照組），其中人參皂苷Rg1組又分為3個亞組（10、20、

2、40 mg/kg組），每組35只。實驗?zāi)Ｐ筒捎米钄啻笫蟠竽X中動脈致局灶性腦缺血再灌注（MCAO）模型，分別選用栓塞2小時后再灌注4小時、22小時作為觀察時間。人參皂苷Rg1各組于術(shù)前5天至取材當(dāng)日分別注射10、20、40 mg/kg的人參皂苷Rg1，陽性藥物對照組給予1 mg/kg的尼莫地平，假手術(shù)組及模型組給予等體積等滲生理鹽水。MCAO術(shù)后24小時，通過神經(jīng)功能評分觀察各實驗組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀的改善情況，動物處死后采用TTC染色

3、觀察大鼠腦梗死體積變化，利用干濕重法觀察大鼠腦水腫情況，采用HE染色觀察大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)的病理學(xué)變化，采用電鏡技術(shù)觀察CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變，利用TUNEL法檢測CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率，采用Nissl染色觀察CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏體的變化，計數(shù)存活神經(jīng)元數(shù)量，采用免疫組織化學(xué)及免疫印跡方法對CA1區(qū)的線粒體途徑（Bcl-2、Bax）及死亡受體途徑（FAS、FAS-L）的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并利用細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)對其進(jìn)行定量

4、分析。于MCAO術(shù)后6小時，采用免疫組織化學(xué)及免疫印跡方法對CA1區(qū)的p-JNK蛋白表達(dá)及其下游效應(yīng)分子c-jun的活化情況進(jìn)行檢測，并利用細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)對其進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1．人參皂苷Rg1對腦缺血再灌注的保護(hù)作用
　　 （1）假手術(shù)組、模型組、人參皂苷Rg110、20、40 mg/kg組和陽性藥物對照組神經(jīng)功能評分分別為0.00±0.00、2.80±0.58、1.96±0.74、1.52

5、±0.82、1.24±0.72、1.44±1.00；與模型組比較，人參皂苷Rg1各組神經(jīng)功能缺損癥狀顯著改善；Rg110 mg/kg組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀雖然減輕，但與陽性藥物對照組比較仍有顯著性差異，而20、40 mg/kg組與陽性藥物對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；Rg1組間比較有顯著性差異，其中以Rg140 mg/kg組改善神經(jīng)功能缺損癥狀的程度最為明顯。
　　 （2）假手術(shù)組、模型組、人參皂苷Rg110、20、40 mg/kg組

6、和陽性藥物對照組腦梗死體積百分比分別為（0.00±0.00）％、（36.20±5.77）％、（27.86±3.72）％、（20.24±3.37）％、（15.72±2.83）％、（18.08±3.78）％；Rg1各組腦梗死體積顯著縮小，與模型組比較有顯著性差異；Rg110 mg/kg組大鼠腦梗死體積雖然減少，但與陽性藥物對照組比較仍有顯著性差異，而20、40 mg/kg組與陽性藥物對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；Rg120、40 mg/kg組與1

7、0 mg/kg組比較均有顯著性差異，其中以Rg140 mg/kg組腦梗死體積減少的程度最為明顯。
　　 （3）假手術(shù)組、模型組、Rg110、20、40 mg/kg組和陽性藥物對照組腦組織含水量分別為（77.77±1.50）％、（83.42±2.75）％、（81.78±1.10）％、（80.77±0.76）％、（78.80±0.78）％、（81.13±1.64）％；Rg120、40 mg/kg組腦組織含水量顯著減少，與模型組比較有

8、顯著性差異，其中以40 mg/kg組腦水腫減輕的程度最為明顯；Rg110mg/kg組大鼠腦組織含水量雖然減少，但與模型組比較無顯著性差異。
　　 （4）Rg1各組右側(cè)海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列較整齊，間質(zhì)水腫程度減輕，神經(jīng)元胞體腫脹減輕，與模型組比較各項病理改變均有不同程度的改善。
　　 2．人參皂苷Rg1抑制腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡
　　 （1）模型組部分神經(jīng)元壞死，也可見不同時期的神經(jīng)元凋亡，有時可

9、見凋亡小體形成；Rg1各組與模型組比較，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及線粒體嵴斷裂程度均有不同程度的減輕，可見少量早期凋亡細(xì)胞，中晚期凋亡細(xì)胞較少見。
　　 （2）假手術(shù)組、模型組、Rg110、20、40 mg/kg組和陽性藥物對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率分別為（1.91±1.46）％、（22.80±5.15）％、（17.08±3.15）％、（14.45±3.22）％、（9.70±1.91）％、（12.42±1.93）％；Rg1各組海馬CA

10、1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著降低，與模型比較有顯著性差異；Rg110、40 mg/kg組與陽性藥物對照組比較均有顯著性差異，其中40 mg/kg組抑制凋亡的程度顯著優(yōu)于陽性藥物對照組，而20mg/kg組與陽性藥物對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 （3）假手術(shù)組、模型組、Rg110、20、40 mg/kg組海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元計數(shù)分別為每高倍視野71.57±9.37、45.77±8.11、50.20±10.21、54.37±8.50、5

11、9.77±7.88、56.50±8.91； Rg120、40 mg/kg組神經(jīng)元存活數(shù)量得到不同程度地提高，與模型組比較有顯著性差異，而Rg110 mg/kg組神經(jīng)元存活數(shù)量雖然有所增高，但與模型組比較無顯著性差異；Rg1各組與陽性藥物對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 （4）假手術(shù)組、模型組、人參皂苷Rg110、20、40 mg/kg組和陽性藥物對照組海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)含量分別為1.54±0.06、1.39±0.76、

12、1.72±0.21、2.76±0.15、4.31±0.89、3.11±0.19，Bax蛋白表達(dá)含量分別為0.30±0.07、4.31±0.55、2.21±0.12、1.80±0.20、0.93±0.08、1.57±0.09；免疫組織化學(xué)與免疫印跡結(jié)果顯示Rgl20、40mg/kg組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增強，Rg1各組Bax蛋白含量顯著降低，Bcl-2/Bax比值顯著提高，與模型組比較有顯著性差異。
　　 （5）人參皂苷Rg1

13、10、20、40 mg/kg組和陽性藥物對照組海馬CA1區(qū)FAS蛋白表達(dá)含量分別為0.28±0.05、3.01±0.24、1.76±0.12、1.51±0.60、1.31±0.13、1.53±0.15，F(xiàn)AS-L蛋白表達(dá)含量分別為0.14±0.02、0.86±0.19、0.72±0.06、0.62±0.16、0.29±0.09、0.52±0.18； Rg1各組FAS、FAS-L平均灰度明顯增高（表達(dá)量減少），蛋白含量顯著降低，與模型組比

14、較有顯著性差異，其中40 mg/kg組FAS、FAS-L蛋白含量最低；10 mg/kg組與陽性藥物對照組比較有顯著性差異，而20、40 mg/kg組與陽性藥物對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3．人參皂苷Rg1抑制腦缺血再灌注大鼠p-JNK、p-c-jun表達(dá)
　　 （1）假手術(shù)組、模型組、人參皂苷Rg110、20、40 mg/kg組和陽性藥物對照組海馬CA1區(qū)p-JNK蛋白表達(dá)含量分別為1.21±0.39、2.27±0.

15、28、2.21±0.27、1.93±0.30、1.64±0.31、1.85±0.41；人參皂苷Rg1各組p-JNK蛋白含量顯著降低，與模型組比較有顯著性差異，其中10 mg/kg組p-JNK蛋白含量最高，40 mg/kg組p-JNK蛋白含量最低；10、40 mg/kg組與陽性藥物對照組比較有顯著性差異，而20 mg/kg組與陽性藥物對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 （2）假手術(shù)組、模型組、人參皂苷Rg110、20、40 mg/kg

16、組和陽性藥物對照組海馬CA1區(qū)p-c-jun蛋白表達(dá)含量分別為0.51±0.07、2.02±0.17、1.21±0.11、0.87±0.22、0.69±0.07、0.80±0.18；模型組大鼠p-c-jun含量最高，假手術(shù)組p-c-jun含量最低；人參皂苷Rg120、40 mg/kg組p-c-jun蛋白含量顯著降低，與模型組比較有顯著性差異，其中40 mg/kg組p-c-jun蛋白含量最低；人參皂苷Rg110 mg/kg組與陽性藥物對照

17、組比較有顯著性差異，而Rg120、40 mg/kg組與陽性藥物對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1．人參皂苷Rg1可以顯著改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀。
　　 2．人參皂苷Rg1能顯著降低腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率；進(jìn)一步研究顯示Rg1可能通過抑制腦缺血后海馬CA1區(qū)的JNK及其效應(yīng)分子c-jun的活化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)死亡受體、線粒體依賴的凋亡途徑，抑制腦缺血再灌注后的神經(jīng)元凋亡，