人脂肪干細(xì)胞在納米細(xì)菌纖維素膜上成骨分化的實驗研究.pdf

1、研究目的
　　 通過研究hASCs和BC膜的生物相容性，以及前者向成骨方向誘導(dǎo)分化的特性來初步探討hASCs和BC作為骨組織工程種子細(xì)胞和支架材料的可行性。
　　 研究方法
　　 1.hASCs傳代培養(yǎng)；
　　 2.掃描電鏡（SEM）觀察BC膜超微結(jié)構(gòu)；
　　 3.倒置顯微鏡觀察hASCs的生長形態(tài)特征；
　　 4.CCK-8檢測hASCs在BC膜上的增殖；
　　 5.冰凍切片/H

2、E染色，及SEM觀察hASCs在BC膜上的粘附；
　　 6.倒置顯微鏡觀察hASCs成骨誘導(dǎo)分化過程中的生長形態(tài)特征；
　　 7.Von Kossa染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶（ALP）染色檢測hASCs的成骨誘導(dǎo)分化；
　　 8.RT-PCR檢測hASCs在不同培養(yǎng)條件下成骨誘導(dǎo)分化中成骨標(biāo)志物Osteopontin（OPN）、Osteocalcin（OC）、和ALP的表達(dá)產(chǎn)物，電泳后測條帶灰度，計算OC/GA

3、PDH、OPN/GAPDH和ALP/GAPDH灰度的比值代表以上基因的相對表達(dá)量；
　　 9.分別比較OPN、OC、ALP基因在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)差異；分析上述三種基因表達(dá)相互之間的聯(lián)系。
　　 研究結(jié)果
　　 1.大體上BC膜呈乳白色半透明膠狀，外表均勻光滑；掃描電鏡下可見細(xì)菌纖維素膜呈超微細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出良好的納米纖維網(wǎng)絡(luò)特征；
　　 2.hASCs在細(xì)菌纖維素膜表面貼附后呈長梭形，隨著時間延長，

4、細(xì)菌纖維素膜表面細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形態(tài)仍然保持長梭形。到9d時細(xì)胞融合成片；
　　 3.hASCs-BC膜復(fù)合培養(yǎng)物冰凍切片及HE染色可見細(xì)胞呈續(xù)的單層貼附生長于細(xì)菌纖維素膜表面，接觸緊密，且未見hASCs長入材料內(nèi)部；
　　 4.掃描電鏡觀察可見hASCs呈長梭形，邊緣伸出突觸，貼附于細(xì)菌纖維素膜生長；
　　 5.hASCs在細(xì)菌纖維素膜表面的增殖良好，細(xì)胞對數(shù)生長期約在3-9天；
　　 6.脂肪間質(zhì)干

5、細(xì)胞成骨分化過程中剛貼壁時仍呈長梭形或橢圓形，之后細(xì)胞形態(tài)逐漸開始出現(xiàn)短梭形和多角形等。隨著誘導(dǎo)時間的延長，由梭形變?yōu)榱⒎叫?、錐形，并有明顯胞漿突出，出現(xiàn)多角形成骨樣細(xì)胞，胞質(zhì)顏色變深，含粗大顆粒，胞核明顯從胞漿伸出許多絲狀偽足，并可見明顯不透光礦化結(jié)節(jié)；
　　 7.在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下，細(xì)胞von Kossa染色hASCs在細(xì)胞培養(yǎng)板和BC膜上均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)大可見量的黑色的礦化物質(zhì)存在。普通干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下均呈

6、陰性反應(yīng)。且同樣培養(yǎng)基條件下組間大體上無明顯差異；
　　 8.在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下，細(xì)胞茜素紅染色hASCs在細(xì)胞培養(yǎng)板和BC膜上均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，可見大量的呈現(xiàn)桔紅色的鈣沉積陽性細(xì)胞。普通干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件下均呈陰性反應(yīng)。且同樣培養(yǎng)基條件下組間大體上無明顯差異；
　　 9.在誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下，ALP染色hASCs在細(xì)胞培養(yǎng)板和BC膜上均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，可見明顯的染成監(jiān)黑色的胞漿，細(xì)胞核為深藍(lán)色。普通干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的

7、條件下BC膜組細(xì)胞胞漿似見較弱的藍(lán)染；
　　 10.RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果顯示：第2周（依次為：0.89±0.09；0.72±0.12；0.43±0.06；0.47±0.05）和第4周（依次為：1.51±0.10；1.47±0.12；1.20±0.15；1.18±0.09）所有細(xì)胞均有ALP表達(dá)，但成骨誘導(dǎo)分化組明顯高于普通培養(yǎng)基組（P<0.001）。OC和OPN在第2周均無明顯表達(dá)，在第4周OPN有較明顯的表達(dá)（

8、依次為：0.51±0.09；0.48±0.07；0.11±0.030.10±0.02），OC微弱表達(dá)（依次為：0.33±_0.09；0.30±0.12；0.12±0.06；0.10±0.05）且同樣培養(yǎng)基條件下組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；
　　 11.成骨誘導(dǎo)過程中OC、OPN和ALP表達(dá)之間存在較強的正相關(guān)性（分別為：r=0.998，P=0.002：r=0.959，P=0.04；r=0.965，P=0.04）。

9、>　　 研究結(jié)論
　　 1.細(xì)菌纖維素膜具有獨特的納米超微結(jié)構(gòu)，hASCs能在其表面良好的增殖和貼附，具有良好的生物相容性；
　　 2.利用含抗壞血酸、β-甘油磷酸和地寨米松的誘導(dǎo)培養(yǎng)基能將hASCs在普通細(xì)胞平板上成功的進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化：
　　 3.利用含抗壞血酸、β-甘油磷酸和地塞米松的誘導(dǎo)培養(yǎng)基能將hASCs在細(xì)胞纖維素膜上成功的進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化；
　　 4.成骨誘導(dǎo)過程中，hASCs形態(tài)發(fā)生明顯