光滑撲蟾(Xenopuslaevis)皮膚抗菌肽的篩選及其相關(guān)研究.pdf

1、抗菌肽( antibacterial peptides)是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的多肽,廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內(nèi)。它除有非特異性的抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體外,還有抗腫瘤細(xì)胞的作用。特別是對多重耐藥菌和腫瘤細(xì)胞有殺傷作用,而不破壞人體的正常細(xì)胞,是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕?是目前抗病原微生物藥物開發(fā)研究中的一個熱點。兩棲類動物皮膚光滑、裸露,沒有鱗片、甲殼和毛發(fā)的保護(hù),但能分泌具有良好保護(hù)作用的皮膚粘

2、液,皮膚粘液中含有大量分子結(jié)構(gòu)特殊、功能復(fù)雜多樣的抗菌活性物質(zhì),抗菌肽是其中最重要的生物活性物質(zhì)之一,是兩棲動物機(jī)體先天防御系統(tǒng)的重要組成部分。
　　本研究以光滑爪蟾、中國林蛙,東北林蛙和中華大蟾蜍為實驗材料,通過兩種誘導(dǎo)方式提取這四種兩棲動物的皮膚分泌液,進(jìn)行了一系列的生物活性測定。結(jié)果表明,不同種類的兩棲動物皮膚分泌液生物活性并不相同,不同方法誘導(dǎo)所提取的同一類兩棲動物的皮膚分泌液的生物活性也有差異。體外抑菌活性檢測結(jié)果表明,

3、四種兩棲動物皮膚分泌物對不同菌株均產(chǎn)生不同程度的抑菌效果,其中以光滑爪蟾的抑菌效果最強,除此之外,光滑爪蟾皮膚分泌物還有抑制和殺傷癌細(xì)胞的作用,并具有胰酶抑制劑活性和極其微弱的溶血活性。
　　基于上述結(jié)果,以光滑爪蟾為實驗材料,通過不同方法分離皮膚分泌物中的抗菌肽,并對其結(jié)構(gòu)和功能做進(jìn)一步研究。通過四步分離純化:SephadexG-25凝膠過濾層析、制備型反相高壓液相層析、離子交換層析和分析型反相高效液相色譜層析,分離純化出兩種抗

4、菌肽:AMP-1和AMP-2,通過氨基酸N端測序和MALDI-TOF/TOF-MS人工De nove手動拼接兩種方法相結(jié)合的方式對抗菌肽 AMP-1和AMP-2的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。網(wǎng)上搜庫序列比對后,確定本實驗所獲得的兩種抗菌肽均為首次發(fā)現(xiàn)。對兩種新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽進(jìn)行最小抑菌濃度( MIC)檢測、胰蛋白酶抑制活性檢測、溶血活性檢測和抗腫瘤活性檢測。結(jié)果顯示: AMP-1和AMP-2對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌活性,AMP-2還對綠

5、膿桿菌也有較弱的抗菌活性,并且AMP-1和AMP-2對多種耐藥菌株也具有不同程度微生物來源不可能與兩棲類動物生存環(huán)境的微生物譜系相同,還可能由于我們所檢測的微生物與特定抗菌肽的天然靶向微生物存在差異,因此導(dǎo)致我們沒有檢測到抗菌肽對個別菌株的抗菌活性。除抗菌活性外,AMP-1和AMP-2均有較強的胰蛋白酶抑制活性,同時也表現(xiàn)出了極其微弱的溶血活性。抗腫瘤結(jié)果顯示:AMP-1并沒有殺傷癌細(xì)胞的作用,而AMP-2卻表現(xiàn)出了很好的抗腫瘤的效果,

6、當(dāng)樣品濃度達(dá)到146.6Ug/ml時,AMP-2可以殺死81.1％人乳腺癌細(xì)胞MCF-7。
　　為了進(jìn)一步研究這兩種抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能,本實驗通過ExPASy網(wǎng)站上的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件Jpred對其進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,通過三級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件 CPHmodels對其進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測。以此為基礎(chǔ),通過替換和缺失AMP-1中賴氨酸對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,又得到九條新的抗菌肽。同時在NCBI中進(jìn)行搜索,找到與AMP-1和AMP-2序列相似的抗菌肽,

7、并利用多肽固相合成的方法合成16條抗菌肽。將合成的多肽通過高效液相色譜法進(jìn)行純化,共得到5條純度在99％以上,8條純度在95％以上的抗菌肽。以金黃色葡萄球菌為指示菌,檢測13條純品抗菌肽的抗菌活性,結(jié)合預(yù)測結(jié)果推測抗菌肽AMP-1中每個賴氨酸對抗菌肽的結(jié)構(gòu)以及抗菌活性的作用。由于抗菌肽一般都是含有一螺旋結(jié)構(gòu)的兩親性分子,疏水性及帶電荷數(shù)對其生物活性影響非常大。因此,單一的氨基酸突變就可能很大程度上改變抗菌肽的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。在對抗菌

8、肽AMP-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的過程中,我們又獲得了四條新的具有抗菌活性的抗菌肽。
　　為了進(jìn)一步闡明光滑爪蟾抗菌肽的殺菌機(jī)理,將E.coli ATCC25922與S.aureus ATCC25923菌株分別與光滑爪蟾抗菌肽AMP-1和AMP-2共孵育后進(jìn)行透射電鏡觀察分析,光滑爪蟾抗菌肽對細(xì)菌形態(tài)及細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示:處理前兩者具有完整的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,并且其細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、表面光滑,能觀察到完整的菌毛,細(xì)胞表面沒有損傷。細(xì)胞

9、內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)能與染色液中所含有的處金屬離子結(jié)合而使菌體呈現(xiàn)深黑色。經(jīng)過抗菌肽AMP-1和AMP-2處理后,E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC25923均有部分細(xì)胞內(nèi)容物外泄,細(xì)胞出現(xiàn)破損或腫脹,菌體部分或完全破裂,并伴有細(xì)胞質(zhì)稀釋的現(xiàn)象,細(xì)胞表面存在破損成小孔的地方,細(xì)胞膜界限模糊不清,甚至細(xì)胞膜完全溶解。由于細(xì)胞內(nèi)容物外滲,細(xì)胞質(zhì)解體,形成空腔,致使被染色的細(xì)胞顏色變淺。以上結(jié)果表明,抗菌肽AMP

10、-1和AMP-2能夠使E.coli ATCC25922、S.aureus ATCC25923菌體細(xì)胞壁破裂或者在細(xì)胞表面形成孔洞,內(nèi)容物外泄,最終導(dǎo)致菌體死亡。
　　結(jié)論:本實驗從光滑爪蟾皮膚分泌物中分離純化出兩種新的抗菌肽AMP-1和AMP-2,兩種抗菌肽都具有廣譜抗菌活性,胰蛋白酶抑制活性,微弱的溶血活性。結(jié)構(gòu)預(yù)測后對抗菌肽AMP-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,又獲得四種新的具有抗菌活性的抗菌肽AMP-1-2、AMP-1-3、AMP-1-4