血紅素加氧酶-1基因轉(zhuǎn)染在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、目的:觀察腺病毒介導(dǎo)的血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因轉(zhuǎn)染在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用；探討調(diào)節(jié)血紅素加氧酶基因表達(dá)對臨床腦卒中的治療前景。方法:建立攜帶血紅素加氧酶-1基因的腺病毒載體:取大鼠脾臟細(xì)胞提取總RNA,參考GeneBank公布的大鼠HO-1序列(J02722)設(shè)計上下游引物,采用反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增HO-1基因；采用AdEasy System方法構(gòu)建包含HO-1基因的重組腺病毒載體(

2、Ad-HO-1)。測得Ad-HO-1和空載體腺病毒(Ad-GFP)滴度分別為2.5×1011PFU/ml、2.0x1011 PFU/ml。健康雄性SD大鼠72只隨機(jī)分為4組:假手術(shù)對照組(sham group,SH)、生理鹽水組(vehicle group,V)、空載體組(adenovirus group,Ad)和Ad-HO-1轉(zhuǎn)染組(HO group),各組18只。后3組在缺血前3d于大鼠右側(cè)腦室分別注射20μl生理鹽水、20μl生理

3、鹽水含空載體腺病毒(1.0×1010 Plaque-forming unit/ml,PFU/ml)和重組HO-1腺病毒(1.0×1010PFU/ml)1μl,注射方法部位參照Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜。連續(xù)注射3d后,參照zea-Longa線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌注模型,大鼠予以2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,術(shù)中麻醉機(jī)控制持續(xù)吸

4、入2％異氟烷,用線栓阻斷右側(cè)MCA的血液供應(yīng),阻斷大腦中動脈2h后退出線栓,給予再灌注。術(shù)中以手術(shù)恒溫設(shè)備將直腸溫度控制在36.5～37.5℃,以探針監(jiān)測大鼠顳溫,多普勒探針檢測腦缺血局部血流。每組大鼠在缺血再灌注后24小時測定Garcia神經(jīng)功能評分,然后處死大鼠并取全腦標(biāo)本,行腦切片采用TTC染色法測定大腦梗死體積,并計算梗死體積百分比。于腦缺血再灌注2h后取腦組織勻漿檢測細(xì)胞凋亡指標(biāo)Caspase-3活性；于再灌注2h后取腦切片行

5、,TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡率。在熒光顯微鏡下觀察連續(xù)轉(zhuǎn)染后24h時腦組織熒光蛋白的表達(dá)情況,并計算轉(zhuǎn)染率。Western-blot檢測轉(zhuǎn)染后24h腦組織HO-1的表達(dá)。結(jié)果:轉(zhuǎn)染后HO-1表達(dá)的變化:Western blot檢測示:HO組大鼠腦內(nèi)HO-1表達(dá)顯著高于Ad組和V組,Ad組和V組比較HO-1表達(dá)無明顯差異。綠色熒光蛋白示轉(zhuǎn)染率:顯微鏡下觀察Ad組和HO組的大鼠腦切片,均可見有綠色熒光蛋白表達(dá)且兩組比較綠色熒光蛋白表達(dá)量無明

6、顯差異,并測定轉(zhuǎn)染率為(34.5±3.4)％。神經(jīng)功能評分:在腦缺血再灌注后24h,SH、V、Ad、HO四組大鼠的神經(jīng)功能評分分別為18、9.571±0.254、9.857±0.149、12.75±0.211,HO組大鼠神經(jīng)功能評分均顯著優(yōu)于Ad組和V組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.001)；Ad組與V組比較神經(jīng)功能評分無明顯差異。梗死體積及細(xì)胞凋亡的檢測:a.腦梗死體積:在腦缺血再灌注后24h,SH、V、Ad、HO四組大鼠的腦梗死體積百分

7、比分別為O％、60.36±6.750％、61.80±7.544％、27.31±2.913％,與SH組比較,V組、Ad組腦梗死體積百分比顯著增高；與V組及.Ad組比較,HO組腦梗死體積百分比顯著降低(P<0.01)；Ad組與V組比較腦梗死體積百分比無顯著差異。b.神經(jīng)細(xì)胞凋亡:在腦缺血再灌注后2h,SH、V、Ad、HO各.組中紋狀體、海馬(CA1區(qū))、皮層(缺血半暗帶)的凋亡細(xì)胞陽性率及Caspase-3活性分別為SH組:<0.1％/0.

8、800±0.170、<0.1％/0.441±0.193、<0.1％/0.674±0.186。V組:(53.39±1.742)％18.889±0.352、(34.81±1.206)％/7.750±0.446、(57.67±2.591)％/7.144±0.424。Ad組:(52.27±1.051)％/8.273±0.359、(36.31±2.210)％/8.284±0.264、(59.33±2.951)％/7.744±0.398。HO組:(

9、43.83±1.15)％/6.217±0.313、(27.31±1.382)％/6.428±0.342、(48.94±2.120)％/6.472±0.347。與SH組比較,Ⅴ組、Ad組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性均顯著增高；與Ⅴ組及Ad組比較,HO組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及Caspasc-3活性均顯著降低(P<0.01)；Ad組與Ⅴ組比較神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性均無明顯差異。結(jié)論:通過AdEasy Sytem成功構(gòu)建含有