參附注射液對大鼠急性壓力超負荷及乳鼠心肌細胞缺糖缺氧損傷的影響.pdf

1、目的：采用腹主動脈結(jié)扎的方法制作急性壓力超負荷大鼠模型，研究參附注射液對其進行治療后，以及參附注射液提前干預(yù)后大鼠急性壓力超負荷在不同時間點的血流動力學(xué)及心肌組織病理學(xué)變化，觀察參附注射液對急性壓力超負荷大鼠心肌組織ANP表達水平，及對急性壓力超負荷大鼠心肌組織Na<'+>-K<'+>ATPase與Ca<'2+>-ATPase表達水平的影響，并對腹主動脈結(jié)扎致壓力超負荷大鼠心肌細胞凋亡率及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達的影響進行

2、研究，同時采用體外培養(yǎng)心肌細胞的方法，并造成缺糖缺氧損傷模型，探討參附注射液對急性壓力超負荷大鼠的干預(yù)及治療作用及缺糖缺氧損傷的心肌細胞的作用。 方法：參照相關(guān)文獻制作急性壓力超負荷大鼠模型。實驗分為： (1)藥物治療組：雄性Wistar 大鼠50只，隨機取8只作為假手術(shù)(Sham)組，其余42只行腹主動脈結(jié)扎術(shù)。其中10只大鼠于腹主動脈結(jié)扎術(shù)中死亡，32只存活大鼠隨機分為模型組、參附組、西地蘭組、多巴酚丁胺組，每組8只

3、。假手術(shù)組僅分離腹主動脈而不結(jié)扎。術(shù)后2小時，分離大鼠左側(cè)頸外靜脈，分別推注①參附組：參附注射液0.5ml (人參皂甙3.5mg/1ml)；②西地蘭組：西地蘭0.5ml(0.036mg/1ml)；③多巴酚丁胺組：多巴酚丁胺0.5ml(1.8mg/1ml)。 (2)藥物提前干預(yù)組：65只雄性 Wistar 大鼠隨機分為5組。假手術(shù)組，模型組、參附高劑量組、參附低劑量組及依那普利組，其中假手術(shù)組為5只大鼠，其余四組各15只大鼠。參附

4、高劑量組與低劑量組大鼠分別以8ml/kg及4ml /kg腹腔注射參附注射液，同時以生理鹽水10ml/ kg灌服；依那普利組大鼠灌服依那普利溶液10ml/ kg(0.5mg/ml)，同時腹腔注射生理鹽水(8ml/kg)，每日一次，連用7日后行腹主動脈結(jié)扎術(shù)；假手術(shù)組同時進行腹腔注射(8ml/kg)及灌服生理鹽水(10ml/kg)，7日后作腹部正中切口2cm后鈍性分離腹主動脈但不結(jié)扎腹主動脈。 血流動力學(xué)參數(shù): (1)藥物治

5、療組：術(shù)后2小時，插入左室導(dǎo)管，八道生理記錄儀記錄壓力曲線，計算左室收縮功能參數(shù)：左室內(nèi)壓峰值(LVSP)、左室壓力上升最大速度(+dp/dt<,max>)及左室舒張功能參數(shù)：左室舒張末內(nèi)壓(LVEDP)、左室壓力下降最大速度(-dp/dt<,max>)。 間隔5分鐘后，分別按不同組別從靜脈推注參附注射液、西地蘭及多巴酚丁胺，間隔10分鐘后再次記錄參附組、西地蘭組、多巴酚丁胺組大鼠的血流動力學(xué)參數(shù)。 (2)藥物干預(yù)組：腹

6、主動脈結(jié)扎術(shù)后1/2小時、1小時及2小時，于模型組、參附高劑量組、參附低劑量組及依那普利組中分別取5只大鼠行血流動力學(xué)檢測及其他指標檢測，同時測定假手術(shù)組上述3個時段血流動力學(xué)參數(shù)及其他指標。 采用放射免疫(RIA)法檢測心肌組織ANP表達，分光光度法測定心肌組織中Na<'+>/K<'+>ATPase,Ca<'2+>-ATPase 含量。具體操作步驟按說明書進行采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(TUNEL)檢測心

7、肌細胞凋亡，采用免疫組織化學(xué)染色檢測心肌細胞Bcl-2與Bax 蛋白。采用全自動圖像分析儀于HPIAS-2000圖像分析系統(tǒng)分析棕黃色陽性顆粒的平均吸光度(A)用2-3天Wistar乳鼠進行心肌細胞的分離、純化、培養(yǎng)，實驗時用缺糖 Hanks液代替正常培養(yǎng)基。培養(yǎng)瓶內(nèi)立即充入氮氣(1升/分流量)30秒，造成缺糖缺氧心肌細胞損傷模型。對照組用正常培養(yǎng)基不含氮氣取培養(yǎng)心肌細胞，隨機分為：1組：正常對照組；2組：缺糖缺氧組；3組：缺糖缺氧+參

8、附液高劑量組(含人參皂甙1000μg/ml)；4組：缺糖缺氧+參附液中劑量組(含人參皂甙500μg/ml)；5組：缺糖缺氧+參附液低劑量組(含人參皂甙250μg/ml)；6組：缺糖缺氧+依那普利組(500μg/ml)，于倒置顯微鏡下觀察心肌細胞生長情況和搏動頻率，MTT比色法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測心肌細胞DNA含量、細胞周期及凋亡率。 結(jié)論：本文認為急性壓力超負荷導(dǎo)致心肌射血時阻力增加，心臟做功增加的同時出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性的變化，

9、以適應(yīng)這種后負荷的改變，即心肌重塑，在此過程中心肌的耗氧耗能急劇增加。但機體儲備有限，因此心肌細胞供氧供能相對不足，結(jié)果引起機體神經(jīng)內(nèi)分泌的激活如ANP表達增多，細胞因子分泌增多，進一步引起心肌細胞的重塑，最終形成心室擴張，肥厚；另一方面壓力牽張可直接導(dǎo)致心肌細胞的結(jié)構(gòu)及功能改變，引起相關(guān)基因的表達異常，Na<'+>-K<'+>-ATP酶、Ca<'++>-ATP酶表達的異常，并引發(fā)心肌細胞離子流障礙，同時由于能量及氧代謝異?？梢鹦募〖?/p>

10、胞凋亡，心肌細胞數(shù)目減少，這些因素共同形成心臟舒縮功能障礙，心功能衰竭，臨床上出現(xiàn)心慌、氣喘、乏力、肢冷、水腫等癥狀，這些與中醫(yī)之心氣不足、心腎陽虛證候極為相似，故推測作為心衰根本病因的心腎陽虛之生物學(xué)基礎(chǔ)可能在于心肌能量與氧代謝障礙。因此參附注射液益氣溫陽作用機制可能在于改善了急性壓力超負荷狀態(tài)下心肌異常的能量及氧代謝，減少了心肌ANP表達，有效提高心肌細胞的Na<'+>/K<'+>ATPase及Ca<'2+>ATPase的表達水平，