傳染性鮭魚貧血癥病毒M1蛋白的結構與功能研究.pdf

1、許多囊膜病毒都能夠編碼基質蛋白，包括副粘病毒、正粘病毒、皰疹病毒、逆轉錄病毒和脊髓灰質炎病毒。病毒的基質蛋白也被稱為病毒裝配“適配器”，因為它能介導病毒包膜或糖蛋白與病毒核糖核蛋白(RNP)復合物的相互作用，從而促進病毒基因組組裝進新裝配的病毒中。正粘病毒家族所有的成員，包括流感病毒A、B、C、索戈托病毒屬，以及Isavirus，都編碼基質蛋白，并稱為M1。在A型流感病毒中，基質蛋白1(M1)在病毒的囊膜下聚集成一層蛋白層，幫助形成感染

2、病毒的形狀以及維持其結構的完整性。研究表明，流感病毒的M1蛋白能介導核衣殼的核輸出以及隨后將其包裝到新的病毒粒子中，還能夠介導病毒的出芽。盡管對于A型流感病毒M1蛋白的研究十分廣泛及細致，但到目前為止，只有其N端結構域的晶體結構被解析出來。
　　傳染性鮭魚貧血癥病毒(ISAV)是一種能夠導致養(yǎng)殖的大西洋鮭魚高死亡率的重要的正粘病毒。ISAV和流感在病毒結構、基因組成、生活周期以及病毒編碼的各種蛋白的功能上都有很多相似之處，是研究流

3、感病毒蛋白的結構與功能的一個很好的可供選擇的模型。
　　為了從整體上更好地了解正粘病毒M1蛋白的結構和功能，本研究解析了ISAV的M1蛋白(ISAV-M1)全長的晶體結構，分辨率達到了2.6(A)。這是國內外首次報道正粘病毒基質蛋白的全長晶體結構。ISAV-M1的晶體結構表明:其含有一個N端結構域(N-domain)和C端結構域(C-domam)，整體呈現一個肘形。雖然ISAV-M1的N-domain與A型流感病毒M1蛋白的N-d

4、omain在序列上相似度很低，但其在結構上卻是相似的。ISAV-M1的C-domain通過一個延伸的Loop結構與N-domain相連，并且折疊成一個含有4個α-螺旋的螺旋束。在晶體中，ISAV-M1的單體組裝成無限的二維晶格，這種結構特征與流感病毒完整的病毒顆粒中與膜相連的基質蛋白的結構類似。通過脂質體浮選實驗，發(fā)現ISAV-M1是通過靜電相互作用與膜結合的，并且找出了關鍵的膜結合位點是在N-domain上的K63/K66/K68。同

5、時也證實ISAV-M1具有RNA結合活性。此外，用低溫電子斷層掃面檢測ISA病毒粒子，發(fā)現ISAV-M1在病毒的包膜下面形成一層蛋白基質。將ISAV-M1的二維晶格擬合到斷層掃描圖片中，能夠很好地與基質蛋白層的密度厚度相吻合，這說明本研究的二維M1晶格很好地模擬了真實狀態(tài)下感染顆粒中的基質蛋白層。
　　有研究表明，ISAV的NS1和M2都是I型干擾素拮抗劑。而對于M1或NEP的特性認識卻非常少。此外，之前的研究稱熱休克同源蛋白70

6、(Hsc70)能夠與流感病毒的M1和NEP蛋白相互作用，為病毒的核糖核蛋白（vRNP）通過vRNP-M1-NEP復合物的輸出提供幫助。因此，本研究檢測了在單獨表達或共表達的情況下，ISAV的M1、NEP蛋白以及Hsc70蛋白的細胞亞定位情況。同時，這三個蛋白的相互作用也用pull-down實驗進行了驗證。本研究的目的是闡明ISAV的M1蛋白和NEP蛋白以及細胞的Hsc70的亞細胞定位以及相互作用。結果表明:當M1、NEP以及Hsc70蛋

7、白單獨表達在雜交鱧(SSN-1)細胞中時，發(fā)現M1是同時定位在細胞質和細胞核中的，NEP則是只定位在細胞質中并且在細胞核周圍聚集，而Hsc70是遍布在細胞質中且細胞核中沒有。當這三個蛋白兩兩共表達時，我們發(fā)現M1和Hsc70都分別能夠與NEP共定位在細胞質中并聚集在細胞核周圍。而M1和Hsc70共表達時，其定位情況與單獨表達時類似。與此同時，本研究還進行了pull-down實驗來驗證三個蛋白之間的相互作用。結果表明，NEP能夠分別與M1