核因子-κB p50亞基調(diào)控組織因子的機(jī)制及在動(dòng)脈內(nèi)膜增生中作用的研究.pdf

1、[研究背景]：組織因子是一種含有糖基的單鏈跨膜蛋白，分子量47KD。組織因子是啟動(dòng)凝血的關(guān)鍵因子，它可以同時(shí)激活凝血因子Ⅸ和X，從而啟動(dòng)內(nèi)、外源性兩種凝血酶聯(lián)放大反應(yīng)，在凝血過程中起著重要作用。隨著對(duì)組織因子研究的加深，現(xiàn)在已知組織因子可以不僅作為凝血因子啟動(dòng)凝血途徑，而且在動(dòng)脈粥樣硬化、胚胎血管發(fā)育、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、炎癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中都具有重要的作用。 鑒于組織因子在多種生理和病理過程中起著重要的作用，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控就可以干預(yù)

2、組織因子相關(guān)疾病的病理進(jìn)程，因此針對(duì)調(diào)控組織因子表達(dá)的研究具有重大的理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。研究表明，組織因子的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平上受調(diào)控，它的啟動(dòng)子區(qū)包含有：5個(gè)SP1、3個(gè)Egr～1、2個(gè)AP-1、1個(gè)NF-k B位點(diǎn)。其中SP1位點(diǎn)主要負(fù)責(zé)調(diào)控組織因子的本底水平的組成性表達(dá)，而Egr-1、AP-1和NF-kB位點(diǎn)則主要負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞中誘導(dǎo)性組織因子的表達(dá)。 應(yīng)用人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞研究組織因子表達(dá)的研究證實(shí)，

3、存在一個(gè)56bp的增強(qiáng)子(-227-172)介導(dǎo)人組織因子的產(chǎn)生。這個(gè)啟動(dòng)子含有一個(gè)NF-kB位點(diǎn)和兩個(gè)AP-1位點(diǎn)，這三個(gè)位點(diǎn)對(duì)誘導(dǎo)性組織因子的產(chǎn)生是必需的。 在以往的研究中，p65/c-Rel被認(rèn)為是作用于組織因子啟動(dòng)子中的NF-kB位點(diǎn)的主要Rel家族蛋白二聚體，但是對(duì)于p50/p65是否可以調(diào)控組織因子則沒有深入而系統(tǒng)的研究。在Rel家族蛋白形成的二聚體，含量最豐的二聚體是p50/p65，p50/p65是NF-k B信號(hào)

4、通路的主要執(zhí)行因子，所以探討其是否可以調(diào)控組織因子的表達(dá)具有理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。雖然p50自身不能活化轉(zhuǎn)錄，但是p65的進(jìn)核需要依賴p50，只有p50和特定的DNA靶序列結(jié)合以后，p65才能發(fā)揮其活化作用。既然p65發(fā)揮調(diào)控基因作用的前提是p50能否結(jié)合到靶DNA序列，因此探討p50是否可以與組織因子啟動(dòng)子中的NF-kB位點(diǎn)結(jié)合就可以明確p50/p65是否可以調(diào)控組織因子的表達(dá)。 [目的]：本研究旨在探尋： (1)核

5、因子-kB p50亞基是否調(diào)控組織因子的表達(dá)； (2)核因子-k B p50亞基調(diào)控組織因子在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈內(nèi)膜增生中的作用； (3)初步篩選靶向抑制核因子-k B p50亞基的小分子化合物。 [研究方法]：本研究分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分。 一.體外實(shí)驗(yàn)：探尋核因子-k B p50亞基調(diào)控組織因子表達(dá)的分子機(jī)制。 (一)分離并培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人外周單核細(xì)胞及小鼠腹腔巨

6、噬細(xì)胞備用。 (二)用核因子-k B p50亞基抑制劑——穿心蓮內(nèi)酯預(yù)處理人及小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，再用脂多糖、佛波酯、腫瘤壞死因子分別刺激上述細(xì)胞，然后應(yīng)用組織因子活性測定技術(shù)、蛋白免疫印記技術(shù)檢測通過穿心蓮內(nèi)酯藥物干預(yù)或/和p50基因敲除是否可以起到下調(diào)活化的內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞組織因子表達(dá)的作用。 (三)應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以證明穿心蓮內(nèi)酯阻止核因子～k B p50亞基與TF-kB位點(diǎn)(組織因子啟動(dòng)子

7、中NF-kB結(jié)合的位點(diǎn))的結(jié)合，2而不是AP-1，Sp1和Egr-1位點(diǎn)。 (四)分別應(yīng)用電泳遷移率變動(dòng)分析、染色體免疫沉淀兩種技術(shù)手段證明p50是否可以與人組織因子啟動(dòng)子中的TF-KB位點(diǎn)結(jié)合。 (五)將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人外周單核細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞按照5000個(gè)/孔的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，應(yīng)用細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)(MTT)明確穿心蓮內(nèi)酯有無細(xì)胞毒性。 二．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：證明核因子-k

8、B p50亞基對(duì)組織因子表達(dá)調(diào)控的功能重要性。 (一)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行如下分組：(1)C57鼠只進(jìn)行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎而不給予任何藥物，作為正常模型組；(2)C57鼠在左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后給予穿心蓮內(nèi)酯治療，作為藥物實(shí)驗(yàn)組；(3)C57鼠在動(dòng)脈結(jié)扎后給予DMSO(溶解穿心蓮內(nèi)酯的溶劑)治療，作為溶劑陰性對(duì)照組；(4)C57鼠在動(dòng)脈結(jié)扎后給予氫化穿心蓮內(nèi)酯(穿心蓮內(nèi)酯的非活性形式)治療，作為藥物陰性對(duì)照組；(5)C57鼠進(jìn)行左側(cè)頸總動(dòng)脈

9、結(jié)扎后給予穿心蓮內(nèi)酯加組織因子抗體復(fù)合治療；(6)C57鼠在動(dòng)脈結(jié)扎后給予組織因子抗體治療;(7)C57鼠在動(dòng)脈結(jié)扎后給予IgG治療，作為組織因子抗體治療組的陰性對(duì)照組；(8)p50敲除鼠只進(jìn)行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎而不給予任何藥物；(9)p50敲除鼠進(jìn)行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后給予穿心蓮內(nèi)酯治療；(10)p50敲除鼠進(jìn)行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后給予組織因子抗體治療；(11)B6野生對(duì)照鼠，該組動(dòng)物只進(jìn)行動(dòng)脈結(jié)扎而不給予任何藥物，作為野生鼠正常模型組。

10、 (二)通過結(jié)扎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)頸總動(dòng)脈完成實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈內(nèi)膜增生的動(dòng)物模型。 (三)利用H&E染色、EVG染色技術(shù)顯示血管的彈性膜，統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組之間增生內(nèi)膜、內(nèi)膜/中膜比值之間的差異，評(píng)價(jià)單獨(dú)或復(fù)合應(yīng)用穿心蓮內(nèi)酯治療、組織因子多克隆抗體治療、p50基因敲除在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈內(nèi)膜增生中的作用。 (四)利用免疫組化、免疫灰度統(tǒng)計(jì)、免疫熒光共定位等技術(shù)，觀察穿心蓮內(nèi)酯治療和p50敲除對(duì)組織因子、E-selectin、VCAM-1表達(dá)

11、的影響。 (五)獲取人動(dòng)脈脈管炎標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化技術(shù)了解NF-kB目標(biāo)蛋白如組織因子、E-selectin、VCAM-1等和臨床疾病的相關(guān)性。 [結(jié)果]：本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明： (1)從p50敲除鼠分離的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化后，組織因子的表達(dá)減少； (2)穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制活化內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組織因子的表達(dá)； (3)p50蛋白能與人組織因子啟動(dòng)子中的TF-kB位點(diǎn)結(jié)合，穿心蓮內(nèi)酯特異性地抑制

12、p50結(jié)合到TF-k B； (4)抑制p50蛋白或敲除P50基因可以減輕動(dòng)脈內(nèi)膜增生； (5)取材于本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的的組織標(biāo)本證明，浸潤的巨噬細(xì)胞、活化的內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞表達(dá)組織因子； (6)抑制p50蛋白或者敲除p50基因可以減少動(dòng)脈內(nèi)膜增生中組織因子的表達(dá)； (7)抑制p50蛋白敲除P50基因可以下調(diào)動(dòng)脈增生內(nèi)膜中E-selectin、VCAM-1的表達(dá)； (8)應(yīng)用組織因子多克隆抗體阻斷

13、組織因子的活性可以減輕動(dòng)脈內(nèi)膜增生； (9)在人的動(dòng)脈血栓中，NF-k B調(diào)控的目標(biāo)基因也有高表達(dá)； (10)15uM穿心蓮內(nèi)酯不抑制細(xì)胞生長，無明顯的細(xì)胞毒性。 [結(jié)論]： (1)本研究首次明確地證明了核因子-k B p50亞基可以與人組織因子啟動(dòng)子中的TF-kB位點(diǎn)結(jié)合，從而發(fā)揮對(duì)組織因子的調(diào)控作用； (2)利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，本研究證明了穿心蓮內(nèi)酯阻止了核因子-k B p50亞基與TF

14、-kB位點(diǎn)的結(jié)合； (3)核因子-k B p50亞基對(duì)組織因子的調(diào)控在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈內(nèi)膜增生中起著重要的作用； (4)核因子-k B p50亞基抑制劑——穿心蓮內(nèi)酯可以顯著減緩實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈內(nèi)膜增生的進(jìn)程。E-selectin、VCAM-1、組織因子的表達(dá)在穿心蓮內(nèi)酯治療鼠中均有顯著的下調(diào)； (5)靶向抑制核因子-k B p50亞基的小分子化合物穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)過進(jìn)一步修飾有可能成為治療血栓和炎癥相關(guān)疾病的新藥。 總