肝門部膽管癌N-糖組學(xué)及microRNAS的研究.pdf

1、膽管癌(Cholangiocarcinoma)又稱Klatskin瘤，是指原發(fā)于膽囊管開口以上的肝總管至左、右肝管部，位于粘膜上皮的惡性腫瘤，約占肝外膽管癌58％-75％以上，組織學(xué)類型多為腺癌.近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，但是其發(fā)生機(jī)制、發(fā)病原因及誘因不明確，因?yàn)槠淦鸩‰[匿，所以出現(xiàn)臨床癥狀--黃疸、腹痛時(shí)大多已到晚期，早期診斷困難，而且由于肝外膽管癌所處的特殊解剖位置及其向周圍組織、血管、神經(jīng)浸潤的生物學(xué)特性，外科根治性切除率低，預(yù)后

2、較差，且術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率較高，其死亡率亦呈逐年上升趨勢。現(xiàn)在對于肝門部膽管癌的診斷主要靠B超、CT、MRCP、PTCD等影像學(xué)的檢查，雖然上述檢查對于晚期肝門部膽管癌檢查準(zhǔn)確性較高，但是對于早期肝門部膽管癌卻無法診斷，對于病人的愈后和生存時(shí)間無明顯提高，一般認(rèn)為對肝門部膽管癌敏感性較高的指標(biāo)有CEA、CA242、CA50、CA199。上述標(biāo)記物血中的陽性率雖較高，但缺乏特異性，對于早期病人敏感性較差，所以尋找對于肝門部膽管癌早診斷、早治療

3、的非創(chuàng)傷性腫瘤標(biāo)志物顯得尤其重要。
　　 多糖和蛋白質(zhì)、核酸一起構(gòu)成生命的三類大分子。多細(xì)胞生物表面覆蓋的糖鏈具有廣泛的生物學(xué)意義，如影響細(xì)胞的發(fā)育、分化和形態(tài)的維持，參與細(xì)胞免疫和細(xì)胞間識別，組成血型抗原，作為惡性細(xì)胞標(biāo)記等；糖蛋白中的糖鏈在蛋白質(zhì)的折疊，運(yùn)輸和定位中也起著重要作用。糖鏈的這些功能也是其與多種疾病相關(guān)的基礎(chǔ)，在急性或慢性炎癥性疾病，自身免疫病、惡性腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均可發(fā)現(xiàn)糖蛋白的糖鏈組成或糖基化程度

4、的改變。異常糖基化的數(shù)量及質(zhì)量上的變化有望成為這些疾病早期非創(chuàng)性診斷的依據(jù)。如今，隨著凝集素微陣列技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)等技術(shù)被引入糖組學(xué)的研究，糖鏈的檢測有了很大的進(jìn)展。Callewaert等利用ABI377DNA測序儀對血清蛋白N-糖鏈檢測技術(shù)的建立更是為我們提供了簡單、快速、高通量檢測N-糖鏈的方法，使血清N-糖鏈檢測運(yùn)用于臨床診斷和預(yù)測成為可能。
　　 微小RNA(microRNAs，

5、miRNAs)是一種內(nèi)源性編碼小分子RNA，長度約為21～25個(gè)核苷酸組成，廣泛存在于真核生物中，通過堿基配對與靶基因進(jìn)行相互作用來降解靶mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，參與生物體內(nèi)多種重要的生物學(xué)進(jìn)程。許多研究表明，miRNA在人體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮非常重要的作用，已發(fā)現(xiàn)若干miRNA與原發(fā)性肝癌、胃癌、小細(xì)胞型肺癌和胰腺癌等的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系。miRNA表達(dá)不僅在組織中發(fā)生變化，在外周血循

6、環(huán)中的miRNA的表達(dá)也會發(fā)生變化并且其在血液中十分穩(wěn)定，這些變化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，這些改變可作為腫瘤等疾病的診斷標(biāo)志物，為臨床疾病的早期診斷提供新思路。對于外周血中腫瘤特異性miRNA的檢測，可以對腫瘤的早期診斷、早期治療起到至關(guān)重要的作用。
　　 第一部分，肝門部膽管癌大樣本臨床病例N-糖組學(xué)研究
　　 本研究從肝門部膽管癌患者血清N-糖組分析入手，評估N-糖鏈以及N-糖鏈相關(guān)的多指標(biāo)聯(lián)合診斷模型在肝門部膽

7、管癌早期診斷的價(jià)值。我們采用DSA-FACE的方法，檢測了98例研究對象(44例膽管癌患者，9例先天性膽管囊腫，17例膽結(jié)石患者和28例正常對照)的血清N-糖組圖譜，比較膽管癌、膽管囊腫及膽管結(jié)石狀態(tài)下其特征性改變，并分析各峰值的差異。應(yīng)用完全隨機(jī)方差分析，并用ROC曲線評估各指標(biāo)的診斷效力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)N-糖鏈結(jié)構(gòu)(peak10,Peak9)可作為膽管癌的特異性診斷標(biāo)志物；peak1及peak2可以作為膽管囊腫的特異性標(biāo)志物。pea

8、k10及CA19-9在診斷膽管癌的診斷效力較高，其AUC均大于0.8，CA199-9，在區(qū)分膽管癌及正常對照是的診斷效力比peak10要高，但是peak10在區(qū)分膽管癌與膽囊管囊腫及膽結(jié)石時(shí)，診斷效力要比CA19-9的診斷效力要高。Peak1在診斷膽管囊腫是的診斷效力較高。結(jié)論：peak10可能作為一種新的無創(chuàng)傷的膽管癌的診斷標(biāo)志物，可以作為CA19-9的有力的補(bǔ)充，可以在CA19-9陰性的病人中提供一種新的診斷方式，并且可以為我們探索

9、膽管癌的發(fā)生機(jī)制提供一定的啟示，同時(shí)peak1也可以作為膽管囊腫的特異性診斷指標(biāo)，為膽管囊腫的發(fā)生機(jī)制提供一定的幫助。
　　 第二部分，肝門部膽管癌大樣本臨床病例微小RNA的研究
　　 本研究從肝門部膽管癌患者血清microRNAs的變化分析入手，評估m(xù)icroRNAs圖譜變化在肝門部膽管癌早期診斷的價(jià)值。根據(jù)以前文獻(xiàn)資料的報(bào)道，我們遴選了5種與肝門部膽管癌相關(guān)的microRNAs：miR-21、miR-106a、miR

10、-224、miR-224-2、miR-370作為研究對象，采用逆轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription，RT)和定量PCR(QuantitativePCR，(qPCR)的方法，檢測了98例研究對象(44例肝門部膽管癌，24例膽管良性病，包括膽總管囊腫和膽囊炎，以及20例正常對照)的血清microRNAs的變化，比較肝門部膽管癌、膽管良性疾病與健康人之間的特征性改變，并用獨(dú)立樣本方差分析(one-wayANOVA)分析及LSD兩兩

11、分析各來分析各個(gè)病種血清中microRNAs的表達(dá)差異，并用ROC曲線評估各指標(biāo)的診斷效力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21在膽管癌、膽管良性病及健康人血清中的表達(dá)有顯著性差異(p=0.018)，膽管癌與膽管良性病比較有顯著性升高(p=0.016)，與健康人比較有顯著性升高(p=0.021)，而膽管良性病與健康人之間表達(dá)無顯著性差異；miR-106a在膽管癌、膽管良性病及健康人血清中的表達(dá)有顯著性降低(p=0.044)，在膽管癌與健康人血清相比較，

12、表達(dá)有顯著性降低(p=0.019)，與膽管良性腫瘤比較未見顯著性差異，膽管良性病與健康人比較未見顯著性差異；miR-21及miR-106a在不同類型膽管癌患者及是否有淋巴轉(zhuǎn)移的患者血清中的表達(dá)都沒有顯著性差異。miR-21在區(qū)分膽管癌和健康人時(shí)的ROC曲線下面積AUR=0.745，在區(qū)分膽管癌及膽道良性腫瘤時(shí)的ROC曲線下面積AUR=0.686。miR-106amiR-21在區(qū)分膽管癌和健康人時(shí)的ROC曲線下面積AUR=0.714。其余