異種骨移植材料的制備與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一章、異種骨移植材料的制備與生物學(xué)特性研究 目的：異種骨移植可以解決臨床上自體骨與同種骨來源不足的問題，目前常用的處理方法雖可有效降低其免疫原性，但破壞了骨誘導(dǎo)活性與生物力學(xué)性能。α-半乳糖抗原(α-Gal)是主要的異種抗原，本研究擬采用α-半乳糖苷酶消化豬骨組織，旨在探索一種既能去除其抗原性，又保留其力學(xué)性能與成骨活性的異種骨材料處理方法。 方法： (1)豬骨組織的酶消化：取市售新

2、鮮豬骨，清洗去除血液與骨髓組織，酒精脫脂，分別采用酶活性為15U／ml、30U／ml、60U／ml的α-半乳糖苷酶37℃下消化8、16h，徹底清洗； (2)骨組織中α-Gal抗原相對(duì)含量的檢測 (3)豬骨與戊二醛的交聯(lián)：根據(jù)ELISA法檢測結(jié)果篩選出一組較為合理的酶消化條件，將該組豬骨經(jīng)戊二醛交聯(lián)處理，檢測交聯(lián)后豬骨α-Gal抗原相對(duì)含量，并與未經(jīng)酶消化的新鮮豬骨、酶消化豬骨比較，根據(jù)結(jié)果確定制備方法； (4)豬

3、骨組織的形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)制備的豬骨進(jìn)行大體觀察、掃描電鏡觀察，用SmileView軟件測量其腔隙的直徑； (5)豬骨的力學(xué)性能檢測：豬松質(zhì)骨制備成10mm×10mm×20mm規(guī)格骨塊，按優(yōu)化篩選的方法酶消化，用電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)檢測其抗壓強(qiáng)度與彈性模量，以觀察酶消化對(duì)異種骨材料力學(xué)性能的影響。 結(jié)果： (1)豬骨組織的酶消化：不同活性的α-半乳糖苷酶消化不同時(shí)間的豬骨組織中α-gal抗原含量不同，酶消化一定時(shí)間后O

4、D值趨于穩(wěn)定，優(yōu)化篩選酶消化條件為酶活性30U／ml的α-半乳糖苷酶消化8h； (2)豬骨與戊二醛的交聯(lián)：30U／ml消化8h組與交聯(lián)組的α-Gal抗原相對(duì)含量差異不顯著，而與新鮮豬骨有顯著性差異(P<0.05)。 (3)豬骨的形態(tài)學(xué)觀察：掃描電鏡觀察表明制備的豬骨為呈三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，其腔隙大小在150μm-600μm之間，骨小梁上分布有孔徑在10μm-100μm的小孔； (4)力學(xué)性能檢測：各試驗(yàn)組材料的抗壓

5、強(qiáng)度、彈性模量均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，酶消化對(duì)力學(xué)性能的無顯著影響。 結(jié)論：優(yōu)化篩選較為合理的豬源性異種骨的酶消化方法為酶活性30U／ml的α-半乳糖苷酶37℃下消化8h，制備方法有效去除了α-Gal抗原，對(duì)豬骨材料的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能無明顯影響。 第二章、異種骨移植材料的生物學(xué)評(píng)價(jià) 目的：采用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法，評(píng)價(jià)所制備的豬骨材料的生物相容性。 方法： (1)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

6、(BMSCs)培養(yǎng)：取乳兔四肢骨骨髓，原代培養(yǎng)8-10天后傳代培養(yǎng)，用臺(tái)盼藍(lán)染色方法判定細(xì)胞活力，取F1、2、3代細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測表面抗原CD44陽性率。 (2)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)：采用MTT法檢測豬源性異種骨對(duì)BMSEs生長增殖的影響。經(jīng)酶消化的5mm×5mm×5mm豬源性異種骨小塊，參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》，按1g豬骨：10ml浸提液的比例，無菌密閉容器內(nèi)10％胎牛血清(FBS)L-DMEM培養(yǎng)液3

7、7℃浸取72h，取上清液加作為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基，以含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)液為對(duì)照。以F3代BMSCs為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，制成細(xì)胞濃度約1×105／ml的細(xì)胞懸液，5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h，按組別分別以異種骨浸提液與對(duì)照培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔24h取5孔，MTT法檢測吸光值。 (3)豬骨與兔BMSCs的復(fù)合培養(yǎng)：將F3代兔BMSCs消化成濃度為1×105／ml左右的細(xì)胞懸液，接種于5mm×5mm×5mm的經(jīng)酶消化的豬骨小塊上，加1

8、0％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基至液面沒過骨塊，置于5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的1w，2w，3w，倒置相差顯微鏡下觀察材料周圍細(xì)胞生長情況，取材后2.5％戊二醛固定3h，脫水，干燥，噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)與生長情況。 (4)動(dòng)物體內(nèi)植入局部刺激反應(yīng)試驗(yàn)：參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886.6-1997進(jìn)行異種骨植入材料局部反應(yīng)評(píng)價(jià)。Wistar鼠18只，體重150g左右，麻醉，于脊柱兩側(cè)皮下及股部肌袋內(nèi)分別植入規(guī)格

9、為5mm×5mm×5mm的豬骨小塊與人骨小塊。術(shù)后大體觀察動(dòng)物飲食、活動(dòng)、切口反應(yīng)等情況。分別于術(shù)后1、4、12周處死6只大鼠，取出植入塊及其周圍包裹的組織，行大體觀察、組織學(xué)觀察。 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)BMSCs的OD值采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，同一時(shí)間點(diǎn)兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。 結(jié)果： (1)BMSCs的培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)均一，生

10、長旺盛，F(xiàn)1-F3代細(xì)胞成活率均在95％左右，F(xiàn)1代、F2代、F3代細(xì)胞CD44陽性率分別為93.9％、95.1％、95.8％。 (2)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)：相同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間OD值無顯著性差異(F=0.070，P=0.7910)，豬骨材料對(duì)BMSCs的生長與增殖無明顯影響，表明其無細(xì)胞毒性。 (3)豬骨與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)：隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，材料周圍細(xì)胞逐漸聚集，細(xì)胞狀態(tài)正常：掃描電鏡下觀察，細(xì)胞在豬骨材料表面緊密貼

11、附生長，細(xì)胞呈多邊形、梭形，有較多的偽足向豬骨材料表面伸出，細(xì)胞形態(tài)正常，功能活躍，表明該材料細(xì)胞相容性良好。 (4)動(dòng)物體內(nèi)植入后的局部刺激反應(yīng)試驗(yàn)：皮下與肌內(nèi)植入后1w，纖維組織包裹并長入植入的豬骨腔隙內(nèi)，伴有較明顯的炎性細(xì)胞浸潤，4w時(shí)，炎癥反應(yīng)減輕，12w時(shí)，植入的豬骨腔隙內(nèi)由疏松的結(jié)締組織充填，炎癥反應(yīng)消失，與周圍正常組織中的無明顯區(qū)別，表明豬骨材料具有良好的組織相容性。 結(jié)論：酶消化法所制備的豬源性異種骨移植

12、材料具有良好的生物相容性。 第三章、異種骨移植材料的骨誘導(dǎo)活性研究 目的：采用免疫抑制大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以異位成骨的方式，通過組織學(xué)觀察、堿性磷酸酶活性測定，評(píng)價(jià)所制備異種骨的骨誘導(dǎo)活性。 方法：實(shí)驗(yàn)組材料為α-半乳糖苷酶消化去抗原的豬皮質(zhì)骨，0.6N的HCI脫礦，以脫礦后經(jīng)高溫高壓處理滅活其成骨活性物質(zhì)的豬骨為陰性對(duì)照。Wistar大鼠24只，體重約150-180g，腹腔注射地塞米松，劑量為每次0.25mg/10

13、0g體重，每3天一次，造成免疫抑制。大鼠麻醉后，兩側(cè)股部肌袋分別植入實(shí)驗(yàn)組材料和對(duì)照樣品，縫合肌肉皮膚。術(shù)后3、4、5、6w各處死6只大鼠，取出植入材料，固定，包埋，行組織學(xué)觀察；將植入物稱重，研磨粉碎，加2ml生理鹽水提取，3000rpm離心20min，取上清液，測堿性磷酸酶(ALP)活性。 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)ALP活性檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，同一時(shí)間點(diǎn)兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水

14、準(zhǔn)為α=0.05。 結(jié)果：組織學(xué)觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組植入材料3w時(shí)被纖維組織包裹，其吸收腔內(nèi)可見有間充質(zhì)細(xì)胞開始長入：可見有間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變形成軟骨細(xì)胞，并開始分泌形成軟骨基質(zhì)；4w時(shí)植入材料內(nèi)有較多軟骨組織形成；5w時(shí)形成成熟的軟軟骨組織；6w時(shí)，成骨更為活躍，植入材料內(nèi)有更多的成熟軟骨組織形成，在其邊緣吸收腔隙內(nèi)有類骨質(zhì)形成：術(shù)后3-6w，對(duì)照組樣品顯示吸收，但未見成骨相關(guān)的細(xì)胞，也無軟骨或骨組織形成。ALP活性測定結(jié)果顯示，不同

15、時(shí)間點(diǎn)的ALP活性差異顯著(F=321.084，P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著(F=484.330，P=0.000)，同一取材時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組ALP活性均比對(duì)照組高(P<0.05)。 結(jié)論：采用α-半乳糖苷酶消化去抗原的豬源性異種骨保留了良好的骨誘導(dǎo)活性，可以作為一種潛在的骨移植替代材料，來彌補(bǔ)臨床上自體骨與同種骨材料來源的不足。 第四章、異種骨修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究 目的：利用兔橈骨節(jié)段性骨缺

16、損模型，觀察與評(píng)價(jià)所制備豬源性異種骨移植材料對(duì)兔節(jié)段性骨缺損的修復(fù)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：家兔24只，體重2-2.5kg，以雙側(cè)橈骨為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。家兔靜脈注射3％戊巴比妥鈉麻醉，用牙科鉆截?cái)鄻锕歉芍卸?，造成雙側(cè)橈骨約12mm長的節(jié)段性骨缺損，按組植入相應(yīng)骨移植材料。分別于第4、8、12周分批處死動(dòng)物8只，取尺橈骨全段。實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)植入材料不同分組，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4例，A組為空白對(duì)照組，節(jié)段性骨缺損處不植入任何材料，直接

17、縫合，作為陰性對(duì)照：B組為異種骨組，植入酶處理方法制備的去抗原豬骨；C組為兔同種骨組，植入兔松質(zhì)骨；D組為自體骨組，將取下的兔橈骨骨段用無菌生理鹽水清洗后，植于其對(duì)側(cè)骨缺損處。 數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，X線評(píng)分采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，方差齊性時(shí)組間多重比較采用LSD法，不滿足方差齊性要求時(shí)，組間多重比較采用Dunnet’sT3法，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平為α=0.05。 結(jié)果：大體觀察：術(shù)后各組動(dòng)物