曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的影響及分子機理研究.pdf

1、曲馬多和對乙酰氨基酚均是臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥,常用于輕、中度疼痛的緩解,較少應用于神經(jīng)病理性疼痛的治療,對其作用機制的研究也知之甚少；而將兩者聯(lián)合應用于神經(jīng)病理性疼痛的治療,目前更是缺乏相應的實驗研究。本研究通過脊髓腰5(L5)神經(jīng)的結(jié)扎橫切建立大鼠的神經(jīng)病理性疼痛模型,研究了曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對大鼠機械痛覺超敏和熱痛覺過敏的影響,并從小膠質(zhì)細胞及多種促/抗炎因子入手對其機制進行了初步探索。 研究一 神經(jīng)病理性疼痛模型的建立和

2、相關(guān)機制的研究 一、大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型的建立以及機械、熱痛閾改變情況 從出生10～15周,體重230～280g的雄性大鼠中篩選出痛覺反應正常大鼠,按照Kim和Chung的方法通過脊髓腰5神經(jīng)的結(jié)扎橫切建立神經(jīng)損傷模型,術(shù)后觀察一般行為學情況,在術(shù)后第1、3、7、11、14和21天分別用von Frey法和Hargreaves法測量機械縮足反射閾值和熱縮足潛伏期。結(jié)果表明：脊神經(jīng)損傷術(shù)后大鼠一般情況良好,出現(xiàn)了明顯的機

3、械痛覺超敏和熱痛覺過敏表現(xiàn),并在第3天達到高峰,證明大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型制作成功。 二、大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型相關(guān)機制的研究 (一)小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓的表達情況 大鼠脊神經(jīng)損傷手術(shù)后第1、3、7、11、14、21天,完成機械和熱痛閾測量后,多聚甲醛灌注處死動物,取脊髓L4.5節(jié)段用免疫組化方法觀察脊髓小膠質(zhì)細胞的表達活性。結(jié)果顯示：免疫標記物OX-42標記陽性的小膠質(zhì)細胞在正常脊髓后角表達較少,

4、胞體較小,表面有小棘突和細長分支；手術(shù)后各時間點小膠質(zhì)細胞明顯增生,且分支變粗變長,呈阿米巴樣分叉變形。通過細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn),術(shù)后小膠質(zhì)細胞表達第3、7天達到高峰,隨后逐漸減少,到第21天逐漸恢復術(shù)前水平,與大鼠的痛閾改變趨勢類似。 (二)促/抗炎細胞因子在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓及腦中的變化 脊神經(jīng)損傷手術(shù)后第1、3、7、11、14、21天,完成機械和熱痛閾測量后,處死動物,取整段脊髓組織(頸髓至骶髓)和全腦組織,用酶聯(lián)免疫

5、吸附法(ELISA)檢測脊髓和腦組織中多種細胞因子TNF-α、IL-1β、前列腺素E2(PGE2)、及白介素-10(IL-10)的表達情況。結(jié)果顯示：與正常大鼠相比,術(shù)后脊髓、腦組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和PGE2表達顯著增高,均在第3天達到最高峰(PGE2在術(shù)后第7天),變化趨勢與痛閾值變化一致；而抗炎因子IL-10的表達則在術(shù)后逐漸增加,在第21天達到最高峰。 (三)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓

6、及腦中的變化 大鼠行脊神經(jīng)損傷手術(shù)后第1、3、7、11、14、21天,用凝膠電遷移法進行脊髓和腦組織核因子-κB(NF-κB)活性測定。結(jié)果顯示：與正常大鼠相比,術(shù)后脊髓和腦組織中的NF-κB表達明顯增加,并均在第3天達到最高峰,說明脊神經(jīng)損傷手術(shù)可以誘導核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達,并使其在整個實驗過程中均保持較高的水平。 研究二 曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的協(xié)同治療作用 一、腹腔曲馬多聯(lián)合對乙

7、酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型協(xié)同治療作用 將制備成L5脊神經(jīng)損傷術(shù)的實驗動物隨機分為10組,術(shù)后第7天腹腔分別注射對乙酰氨基酚40(Ⅰ組)、80(Ⅱ組)和160 mg/kg(Ⅲ組),曲馬多5(IV組)、10(V組)和20 mg/kg(VⅠ組),對乙酰氨基酚40 mg/kg+曲馬多5 mg/kg(VⅡ組),對乙酰氨基酚80 mg/kg+曲馬多10 mg/kg(VⅢ組),對乙酰氨基酚160 mg/kg+曲馬多20 mg/kg(I

8、X組),生理鹽水對照組(X組)。結(jié)果顯示:與生理鹽水組相比,除各對乙酰氨基酚組及曲馬多5mg/kg組外,其余各組在給藥后各時間點均能顯著提高大鼠的機械和熱痛閾值,明顯減輕機械痛覺超敏和熱痛覺過敏表現(xiàn)；與單獨應用曲馬多相比,曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚腹腔注射對脊神經(jīng)部分結(jié)扎大鼠機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏具有協(xié)同的抗傷害感受性作用。 二、鞘內(nèi)曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型協(xié)同治療作用 將制備成L5脊神經(jīng)損傷術(shù)的實

9、驗動物隨機分為10組,術(shù)后第七天鞘內(nèi)分別注射對乙酰氨基酚8ug(Ⅰ組)、40ug(Ⅱ組)和80ug(Ⅲ組),曲馬多1ug(IV組)、5ug(V組)和10 ug(VⅠ組),對乙酰氨基酚8ug+曲馬多1ug(VⅡ組),對乙酰氨基酚40ug+曲馬多5ug(VⅢ組),對乙酰氨基酚80ug+曲馬多10ug(IX組),生理鹽水對照組(X組)。結(jié)果顯示:與生理鹽水組相比,除各對乙酰氨基酚組及曲馬多1ug組外,其余各組在給藥后各時間點均能顯著提高大鼠的

10、機械和熱痛閾值,明顯減輕機械痛覺超敏和熱痛覺過敏表現(xiàn)；與單獨應用曲馬多相比,曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚鞘內(nèi)注射對脊神經(jīng)部分結(jié)扎大鼠機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏具有協(xié)同的抗傷害感受性作用。 研究三 曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的影響及其相關(guān)機制的研究 一、曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型形成和建立后行為學的影響 (一)曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型形成的行為學的影響

11、 將制備成L5脊神經(jīng)損傷術(shù)的實驗動物隨機分為4組,分別在手術(shù)后當天開始腹腔注射以下各組藥物,每天兩次(10:00、20:00),連續(xù)七天。(1)曲馬多20mg/kg+對乙酰氨基酚160mg/kg、(2)曲馬多20mg/kg、(3)對乙酰氨基酚160mg/kg、(4)生理鹽水。結(jié)果顯示:與生理鹽水對照組相比,單純曲馬多組和曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚組均能抑制神經(jīng)病理性疼痛大鼠熱痛敏和機械超敏的形成,以第3天至第7天的抑制作用最明顯,而且曲馬多

12、聯(lián)合對乙酰氨基酚組表現(xiàn)出的抑制作用可一直持續(xù)至21天。 (二)曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型建立后的行為學的影響 將脊神經(jīng)損傷實驗動物隨機分為四組：分別在手術(shù)后第7天開始腹腔注射以下各組藥物,每天兩次(10:00、20:00),連續(xù)七天。(1)曲馬多20mg/kg+對乙酰氨基酚160mg/kg、(2)曲馬多20mg/kg、(3)對乙酰氨基酚160mg/kg、(4)生理鹽水。與生理鹽水組相比,手術(shù)后第7天開

13、始連續(xù)給與曲馬多+對乙酰氨基酚能減輕疼痛行為學表現(xiàn),以術(shù)后第7天至第14天最明顯,但與假手術(shù)組相比,MWT和TWL值仍有顯著差異,而停止給藥后,曲馬多+對乙酰氨基酚組的MWT和TWL值的差異與生理鹽水組相比,差異無統(tǒng)計學意義。 二、曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓中小膠質(zhì)細胞表達的影響 通過免疫組化方法觀察不同給藥組L4-5節(jié)段小膠質(zhì)細胞的表達情況。結(jié)果顯示：各組動物脊神經(jīng)損傷術(shù)后OX-42

14、標記陽性的小膠質(zhì)細胞均顯著增生,胞體肥大、分支增多呈樹叉樣,主要分布于手術(shù)側(cè)脊髓后角的灰質(zhì)之中；與生理鹽水注射組相比,預先給與曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚組小膠質(zhì)細胞表達含量均明顯減少,以術(shù)后第7天達到最高峰,至術(shù)后21天可恢復正常,而單純曲馬多或?qū)σ阴０被訉π∧z質(zhì)細胞表達的影響與生理鹽水組相比較差異不明顯；而與生理鹽水組相比,術(shù)后第7天開始連續(xù)給與曲馬多+對乙酰氨基酚組中小膠質(zhì)細胞表達含量減少不明顯。 三、曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對

15、神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓中促/抗炎細胞因子含量的影響 運用ELISA的方法檢測了不同給藥組大鼠在脊神經(jīng)損傷術(shù)后第1、3、7、11、14和21天,脊髓和腦組織的TNF-α、IL-1β、PGE2及IL-10的表達情況。結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比,對乙酰氨基酚組、曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚組均能抑制術(shù)后各時間點脊髓和腦組織中的促炎因子TNF-α、IL-1β、PGE2水平；并同時可顯著刺激抗炎因子IL-10的表達,在術(shù)后第11

16、天達到高峰；與生理鹽水組相比,術(shù)后第7天開始連續(xù)注射曲馬多+對乙酰氨基酚也能抑制促炎細胞因子的表達、增加抗炎細胞因子的含量,變化趨勢與大鼠機械和熱痛閾的緩解趨勢一致。 四、曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型形成和建立后脊髓及腦中NF-κB的影響。檢測不同給藥組大鼠在脊神經(jīng)損傷術(shù)后第1、3、7、11、14和21天,脊髓和腦組織的NF-κB活性變化情況。結(jié)果顯示：與正常大鼠相比,術(shù)后生理鹽水注射組大鼠脊髓和腦中的NF-κ

17、B表達明顯增加,并在第3天達到最高峰,在第14天達到第2個小高峰；與生理鹽水組相比,預先腹腔聯(lián)合注射曲馬多+對乙酰氨基酚能顯著抑制脊髓和腦中NF-κB的活性,與大鼠的痛閾值變化趨勢類似；與生理鹽水組相比,術(shù)后第7天開始腹腔聯(lián)合注射曲馬多+對乙酰氨基酚對脊髓和腦中NF-κB活性的抑制并不明顯。 結(jié)論：本研究中通過L5脊神經(jīng)損傷手術(shù)建立大鼠的神經(jīng)病理性疼痛模型,研究曲馬多聯(lián)合對乙酰氨基酚對大鼠機械和熱痛覺敏感程度的影響,并檢測了與疼