MEKK2參與和調制T淋巴細胞受體信號轉導以及皮質激素對人肺成纖維細胞MAPK的作用.pdf

1、一、MEKK2參與T細胞受體信號中JNK激活和IL-2基因表達 JNK(c-Jun N-terminal kinases)是MAPK(mitogen-activated protein kinase)家族基因的成員,對細胞增殖、分化和凋亡十分重要.以前的研究發(fā)現(xiàn)T細胞JNK激活需要T細胞受體和輔助受體如CD28的共刺激.該研究探討MEKK2是否是T細胞中特異的JNK上游活化激酶,是否涉及轉導來自TCR/CD3的T細胞信號激活JNK MA

2、PK級聯(lián)和T細胞特異基因IL-2的表達.利用多組織poly(A)雜交模板,用1kb N-末端人MEKK2做探針行Northern雜交.Jurkat T-細胞用電擊法轉染,COS-1細胞用Lipo-fectamine轉染檢測不同的基因表達或作用.抗JNK抗體免疫沉淀法,GST-cJun為作用底物體外檢測JNK激酶活性;抗HA抗體、GST-JNKK2為作用底物體外檢測MEKK2激酶活性.熒光酶報告基因檢測IL-2和AP—1基因的表達.抗HA

3、抗體12CA5、抗MEKK2抗體11281129、抗磷酸化抗體Pty20和ECL試劑盒進行蛋白印跡檢測.二、小鼠MEKK2基因損毀揭示其在T細胞受體信號轉導中起特殊調制作用 MEKK2是絲裂原蛋白激酶(MAPK)激酶的激酶基因家族成員,涉及調節(jié)多條MAPK信號途徑.MAPK可以被特異的MAPKK在保守的蘇氨酸和酪氨酸上雙磷酸化而激活,MAPKK則由MAPKKK來激活.為了闡明MEKK2在體內的功能,我們制備了攜帶靶向突變MEKK2基因座

4、的小鼠,并進行了系列分析.基因打靶制備MEKK2缺陷小鼠,Southern雜交、PCR方法檢測基因型.免疫沉淀和蛋白印跡方法分析MEKK2的表達.制備純化T細胞,熒光抗體常規(guī)染色標記,流式細胞儀分析T細胞和B細胞亞群.ELISA方法測定細胞因子IL—2、IL—4、IL—5、IL—10和IFN—r.小鼠腹腔注射抗CD3單抗或對照抗體,檢測體內胸腺細胞凋亡.體外分別用抗CD3單抗、抗Fas抗體、地塞米松和紫外線誘導凋亡,PI和FITC—An

5、nexinV雙染檢測.免疫印跡法檢測磷酸化JNK、ERK和p38,膜經(jīng)洗脫抗體后再進行常規(guī)JNK、ERK和p38蛋白印跡分析.三、激素對人肺成纖維細胞MAPK信號傳導途徑的作用 激素是控制代謝、發(fā)育、炎癥、細胞增殖和分化的調控分子.已知激素對多種組織和細胞如淋巴組織、成纖維組織和上皮來源細胞等具有抗增殖作用,臨床上常常利用其抗炎作用治療肺間質性疾病.但是皮質激素導致肺成纖維細胞周期停滯和生長抑制,及其信號傳導通路依然不清楚.為了探討MA