基于生物芯片標(biāo)記技術(shù)的五種瀕危冷杉保護(hù)遺傳學(xué)研究.pdf

1、冷杉屬（Abies）是松科中的第二大屬，全世界約有50種，是組成寒溫性暗針葉林和亞高山暗針葉林的建群樹種，它們組成了高山地區(qū)獨(dú)特的森林景觀，在涵養(yǎng)水源、保護(hù)河川上游水資源方面起著重要作用，是各分布區(qū)高山造林和森林更新的重要樹種；由于該屬樹種耐寒、耐蔭性強(qiáng)，喜氣候涼潤，主要分布于北半球的高海拔或高緯度地區(qū)，在我國的東南部很難見到。1976年以來相繼在我國浙江、廣西、湖南、貴州和江西五省區(qū)發(fā)現(xiàn)5種冷杉新種，百山祖冷杉(A.besganzue

2、nsis)（吳鳴翔定名發(fā)表）、元寶山冷杉(A.yuanpaoshanensis)（呂庸浚和傅立國定名發(fā)表）、資源冷杉(A.ziyuanensis)（傅立國和莫新禮定名發(fā)表）、梵凈山冷杉(A.fanjinshanensis)（黃威廉定名發(fā)表）和大院冷杉(A.dayuanensis)（劉起銜定名發(fā)表）。這5種冷杉植物的發(fā)現(xiàn)否定了以往亞熱帶的低、中山無冷杉分布的觀點(diǎn)，被認(rèn)為是植物地理學(xué)和植物學(xué)上的一大發(fā)現(xiàn)。這幾種冷杉野生群體數(shù)量稀少，全部被列

3、為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。目前這幾種冷杉分類存在爭(zhēng)議，保護(hù)策略缺乏科學(xué)依據(jù)，而且部分材料野生植株極其稀少，如百山祖冷杉野生群體只剩3株。在樣本很少情況下，要開展物種分類和保護(hù)遺傳學(xué)研究只能尋求能大幅度提高檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)的方法才能提高實(shí)驗(yàn)可信度。生物芯片技術(shù)具有高通量、高效率的特點(diǎn)，可以達(dá)到此目的。本論文利用生物芯片技術(shù)的手段，開展了遺傳標(biāo)記生物芯片的制作與檢測(cè)研究，并將該技術(shù)應(yīng)用于5種瀕危冷杉的保護(hù)遺傳學(xué)研究，分析了5種冷杉的分子親源關(guān)系和群

4、體遺傳分化，探討了它們的瀕危原因和保護(hù)策略，并對(duì)冷杉的水培繁殖作了研究，主要結(jié)論如下：
　　1.生物芯片技術(shù)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高,而冷杉葉片中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、多酚和色素類等次生代謝物質(zhì)。本試驗(yàn)采用改良的CTAB法提取了冷杉基因組DNA，有效地去除了各種影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的雜質(zhì)。檢測(cè)結(jié)果表明，提取的DNA樣品的D260 nm/D280 nm比值都為1.9左右，均為白色絮狀沉淀,溶液清亮,無黏稠感,純度較好。在芯片工作緩沖液中

5、檢測(cè)表明，提取的DNA樣品孔均不發(fā)亮,且DNA主帶清晰,無彌散帶，能適應(yīng)生物芯片的工作緩沖液環(huán)境，完全滿足生物芯片技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量的要求。
　　2.實(shí)驗(yàn)以小麥、云杉、為對(duì)照，研究了冷杉基因組DN A復(fù)雜性，將三種材料基因組DNA酶切后，采用不同的選擇性堿基的引物擴(kuò)增。結(jié)果表明冷杉基因組DNA復(fù)雜性高于小麥和云杉，提示冷杉基因組DNA復(fù)雜性降低須采取更有效措施；采用PstⅠ和TaqⅠ兩種酶切組合得到的片段數(shù)過多，提示應(yīng)采用更多種的酶

6、切組合或選擇性堿基引物擴(kuò)增可降低冷杉基因組DNA復(fù)雜性；冷杉基因組含C、G堿基數(shù)可能多于含A、T堿基數(shù)，提示應(yīng)選用相對(duì)富含CG多的限制性內(nèi)切酶可能有利于酶切效果。
　　3.實(shí)驗(yàn)采用7種不同的限制性內(nèi)切酶組合酶切冷杉基因組DNA后，采用有無選擇性堿基的PstⅠ引物擴(kuò)增酶切片段，探討適合冷杉基因組DNA復(fù)雜性降低的方法。結(jié)果表明酶切組合PstⅠ+TaqⅠ+MseⅠ酶切片段在無選擇性堿基引物擴(kuò)增時(shí)片段分布在750bp左右，分子量比較大的

7、片段相對(duì)較少，分布比較均勻集中，從該酶切組合的+3堿基引物擴(kuò)增時(shí)顯示沒有明顯的條帶，說明該酶切組合效果最好；酶切組合PstⅠ+BstNⅠ、PstⅠ+TaqⅠ效果次之，其它幾種酶切組合不甚理想。
　　4.實(shí)驗(yàn)采用PstⅠ+TaqⅠ+MseⅠ酶切組合酶切冷杉基因組DNA樣品構(gòu)建基因組DNA文庫，并用所得文庫點(diǎn)制冷杉基因組DNA芯片，再用同樣酶切方法進(jìn)行樣品處理后與芯片雜交，檢測(cè)各芯片質(zhì)量參數(shù)。檢測(cè)結(jié)果表明芯片樣點(diǎn)基本比率、中值比率和均

8、數(shù)比率相關(guān)系數(shù)均大于0.9，參考通道信噪比為79.017-92.024，雜交后檢測(cè)通道信噪比為20.786-32.827，說明采用該方法得到的芯片質(zhì)量比較好，可以用于構(gòu)建冷杉基因組DNA芯片。
　　5.實(shí)驗(yàn)利用6種冷杉的基因組DNA為建庫材料，研究了冷杉基因組DNA芯片的制作方法，芯片質(zhì)量參數(shù)和有效標(biāo)記參數(shù)的選取，以及不同文庫構(gòu)建方法和不同樣品處理方法對(duì)有效標(biāo)記得率的影響，研究結(jié)果表明：綜合分析后認(rèn)為實(shí)驗(yàn)應(yīng)選取重復(fù)性100％，召回

9、率大于85%標(biāo)記點(diǎn)比較合適，此時(shí)得到的平均有效標(biāo)記得率為18%左右，不同方法制作的芯片文庫具有一定通用性，有效標(biāo)記得率具有一定偏好性，芯片文庫構(gòu)建方法和樣品處理方法相同時(shí)有效標(biāo)記產(chǎn)率最高。
　　6.實(shí)驗(yàn)采用PstⅠ、TaqⅠ和M seⅠ3種限制性內(nèi)切酶混合酶切5種冷杉基因組DNA，并用酶切后的DNA片段制作遺傳多樣性檢測(cè)的芯片檢測(cè)并分析了5鐘冷杉群體內(nèi)遺傳多樣性，分析的遺傳多樣性參數(shù)有多態(tài)位點(diǎn)百分率、觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)

10、、Nei基因雜合度、Shannon多樣性指數(shù)等，并對(duì)結(jié)果做了差異顯著性分析和多重比較，結(jié)果顯示，5種冷杉的遺傳多樣性排序順序?yàn)椋嘿Y源冷杉﹥?cè)獙毶嚼渖缉冭髢羯嚼渖缉兇笤豪渖缉儼偕阶胬渖?種冷杉，資源冷杉和元寶山冷杉差異不顯著，大院冷杉和百山祖冷杉差異不顯著，元寶山冷杉和梵凈山冷杉差異不顯著，其它兩兩間差異極顯著。（具體參數(shù)值見第7章列表）
　　7.實(shí)驗(yàn)采用PstⅠ、TaqⅠ和M seⅠ3種限制性內(nèi)切酶混合酶切5種冷杉基因組DNA，并

11、用酶切后的DNA片段制作遺傳多樣性檢測(cè)的芯片檢測(cè)并分析了5鐘冷杉群體間遺傳分化，并計(jì)算了群體間遺傳距離，利用遺傳距離估算了群體分化時(shí)間，結(jié)果顯示，5種冷杉群體209個(gè)位點(diǎn)平均的總基因多樣度 Ht=0.2608±0.0004,平均的群體內(nèi)基因多樣度Hs=0.1653±0.0004;群體間基因分化系數(shù)Gst=0.3664；群體間基因流Nm=0.8647。5種冷杉中資源冷杉、元寶山冷杉、大院冷杉三種冷杉間親源關(guān)系最接近，這三種冷杉和百山祖冷杉

12、關(guān)系比較接近，梵凈山冷杉與以上4種冷杉關(guān)系最遠(yuǎn)。資源冷杉、元寶山冷杉、大院冷杉相互間分化時(shí)間最短，在4.5千年-9.9千年之間。分化時(shí)間最長的是梵凈山冷杉和百山祖冷杉之間，為54千年。
　　8.試驗(yàn)采用了水培方式研究了在水培條件下生根調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)液對(duì)冷杉水培生根過程中愈傷誘導(dǎo)、生根率、最長根長、平均根長等參數(shù)的影響。結(jié)果表明生根調(diào)節(jié)劑（ABT和IAA）對(duì)誘導(dǎo)百山祖冷杉水培愈傷誘導(dǎo)、生根率、生根數(shù)有明顯作用，兩者都適合在百山祖冷杉水

13、培繁殖中應(yīng)用。但激素處理對(duì)最長根長和平均根長無規(guī)律性影響。營養(yǎng)處理對(duì)百山祖冷杉水培繁殖前期各項(xiàng)均無影響，但在出根后會(huì)影響根的生長。冷杉水培試驗(yàn)研究冷杉繁育提供了新的思路，有望使冷杉脫離瀕?，F(xiàn)狀，使該物種作為水培盆景進(jìn)入尋常百姓的生活，對(duì)于物種多樣性保護(hù)，具有重要的意義。
　　9.末次冰期以來氣候變暖使南方冷杉分布區(qū)極度縮小是冷杉瀕危的直接原因；人為砍伐和對(duì)冷杉生境的破壞是冷杉瀕危的重要原因；工業(yè)廢氣對(duì)環(huán)境的污染間接影響冷杉生境；冷