Studies on Antiviral Activities of Recombinant Plant-Derived Antiviral Proteins-griffithsin and Pokeweed Antiviral Protein Agai.pdf

1、日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)是一種可以由蚊子傳播并能造成腦炎等癥狀的黃病毒，主要在東亞和南亞流行。約30億人生活在日本腦炎病毒流行的地區(qū)。到目前為止，除了免疫接種沒有任何有效的抗病毒治療方法。因此，急需有效的抗病毒制劑來控制日本腦炎病毒的感染。植物來源的抗病毒制劑目前被廣泛研究，從中研發(fā)得到具有抗病毒效果的制劑是一個新的研究方向。本論文旨在研究重組Griffithsin(GRFT)和美洲商陸抗病毒蛋

2、白(PAP)抑制日本腦炎病毒感染的能力，可為研發(fā)新型抗病毒制劑提供新的思路。GRFT是紅藻Griffithsiasp.中分離得到的能夠結(jié)合糖基的蛋白，該蛋白能夠通過阻止一些病毒與細胞間的粘附來起到阻止病毒感染細胞的作用，這些病毒包括HIV-1等。PAP是美洲商陸(Phytolaccaamericana)中存在的一種N-糖苷酶核糖體失活蛋白，具有抗HIV-1等病毒的功能。
　　本論文有四部分組成:
　　1.抗病毒蛋白GRFT的

3、基因合成，克隆，原核表達及純化:通過SOE-PCR方法從頭合成GRFT基因，將基因連接入pCold-I載體構(gòu)建pCold-I-GRFT表達質(zhì)粒。所得質(zhì)粒的正確性由限制性內(nèi)切酶酶切和基因測序確認。GRFT在大腸桿菌中能夠可溶表達，并進一步通過鎳親和層析和分子篩方法純化。蛋白的純度由SDS-PAGE鑒定，并由Westernblot的方法確認其正確性。純化的GRFT蛋白中的內(nèi)毒素通過Detoxi-Gel去內(nèi)毒素柱去除。純化的蛋白用于制備多抗用

4、于后續(xù)的GRFT與病毒的結(jié)合實驗。
　　2.Griffithsin抑制日本腦炎病毒感染的體內(nèi)外實驗:體外細胞實驗結(jié)果表明在細胞感染病毒前用GRFT處理BHK-21細胞可以呈劑量依賴性抑制病毒感染。100g/mlGRFT可以起到99％的抑制作用，而265ng/ml的GRFT(20nM)可以起到50％的抑制作用。結(jié)合實驗表明GRFT可以通過結(jié)合JEV病毒粒子起到抑制病毒感染的作用。小鼠實驗表明感染病毒前腹腔內(nèi)注射GRFT(5mg/kg

5、)可以完全抑制腹腔注射感染日本腦炎病毒造成的死亡。
　　3.商陸抗病毒蛋白PAP的克隆，原核表達及純化:通過PCR的方法從全長PAP基因上擴增編碼成熟PAP蛋白的基因，將基因連接入pET-28a(+)載體中構(gòu)建pET28-PAP表達質(zhì)粒。所得質(zhì)粒的正確性由限制性內(nèi)切酶酶切和基因測序確認。GRFT在大腸桿菌中能夠可溶表達，我們通過鎳親和層析和分子篩方法純化。蛋白的純度由SDS-PAGE鑒定。并由Westernblot的方法確認其正確

6、性。純化的GRFT蛋白中的內(nèi)毒素通過Detoxi-Gel去內(nèi)毒素柱去除。純化的蛋白用于制備多抗用于后續(xù)的PAP入胞實驗。
　　4.PAP蛋白抑制日本腦炎病毒感染的體內(nèi)外實驗:空斑形成實驗、實時定量PCR和Westernblot的結(jié)果表明PAP能夠呈劑量依賴性抑制病毒感染，IC50300ng/ml(23.1nM)。去嘌呤實驗表明PAP抑制日本腦炎感染的作用與其對病毒基因組RNA的去嘌呤作用有關(guān)。小鼠實驗表明腹腔內(nèi)注射PAP可以降低至