CBF-,3-和COR15a基因?qū)煵菘购缘挠绊?pdf

1、煙草(NicotianatabacumL.)，茄科(Soalnaceae)、煙屬(Nicotiana)，主要起源于美洲、大洋洲及南太平洋的一些島嶼，大約在明朝萬(wàn)歷年間(1573～1619年)傳入我國(guó)，目前發(fā)現(xiàn)的煙屬植物有66種。煙草是喜溫作物，1～2℃低溫時(shí)植株即死亡，10～13℃生長(zhǎng)停止。在成熟期晝夜平均在16～17℃以下，葉片品質(zhì)低劣。因此，低溫寒害是影響煙草生產(chǎn)的重要限制因子，嚴(yán)重的影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)將低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)

2、子RD29a控制的GUS基因轉(zhuǎn)入煙草，以探明擬南芥RD29a啟動(dòng)子在煙草植株中的表達(dá)特性；同時(shí)，將該啟動(dòng)子分別控制的擬南芥CBF3低溫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄激活因子基因和COR15a冷誘導(dǎo)基因一起轉(zhuǎn)入煙草，以期利用CBF3的快速和高效激活所有攜帶CRT/DRE元件的冷誘導(dǎo)基因表達(dá)，以及COR15a抗寒基因?qū)夂夏さ葍?nèi)膜系統(tǒng)的強(qiáng)力保護(hù)，達(dá)到提高煙草植株的整體抗寒性和低溫下的光合作用能力的目的。我們期望這種抗寒改良策略在模式植物煙草上的成功，以便為其他經(jīng)

3、濟(jì)作物的抗寒性改良提供理論和實(shí)踐依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.分別將RD29a-GUS基因和RD29a-CBF3與RD29a-COR15a雙價(jià)基因?qū)霟煵莶牧螷326中，PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果表明有陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，初步證明外源基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。 2.轉(zhuǎn)RD29a-GUS基因植株作GUS組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，RD29a啟動(dòng)子在煙草中同在擬南芥中一樣，不具有組織表達(dá)特異性，而是低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。它在25℃常溫下不表

4、達(dá)，10℃左右為誘導(dǎo)臨界溫度，4℃左右穩(wěn)定和高效表達(dá)。 3.轉(zhuǎn)RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙價(jià)基因植株的低溫抗寒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株在1℃48h未出現(xiàn)萎蔫，冰點(diǎn)溫度-2℃，而非轉(zhuǎn)基因植株1℃12h即出現(xiàn)萎蔫狀態(tài)，冰點(diǎn)溫度-1℃。電導(dǎo)率測(cè)定和用Logistic方程擬合，得到轉(zhuǎn)基因植株LT50為-1.01℃左右，非轉(zhuǎn)基因植株LT50為0.86℃。轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜傷害率比非轉(zhuǎn)基因植株低20﹪，半致死溫度低約1

5、.87℃。轉(zhuǎn)基因植株的POD活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量分別是非轉(zhuǎn)基因植株的3.42倍、2.57倍、1.23倍。 4.正常溫度下，轉(zhuǎn)RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙價(jià)基因植株生長(zhǎng)狀況與非轉(zhuǎn)基因植株相似。但田間越冬栽植結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株在抗寒性增強(qiáng)的同時(shí)，在植株形態(tài)上也發(fā)生了變化，主要特征有葉由長(zhǎng)橢圓形變成柳葉狀、莖稈變細(xì)，易折斷、植株由高大直立變矮化、從生枝也增多、腋芽變得明顯等；當(dāng)溫度回升后，植株的生長(zhǎng)也基

6、本恢復(fù)正常，這說(shuō)明以RD29a為啟動(dòng)子的COR15a和CBF3基因的表達(dá)不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物造成不正常生長(zhǎng)的影響。 5.通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙價(jià)基因植株三個(gè)株系T1代種子進(jìn)行Kan抗性萌發(fā)，結(jié)果為100∶27、100∶35和100∶23，均傾向于3∶1，表明該基因在T1代中的分離規(guī)律符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，可能是單拷貝整合到煙草基因組中的。 6.轉(zhuǎn)RD29a-CBF3和RD29a-COR15a雙