人增生性瘢痕與正常皮膚組織MicroRNA差異表達(dá)及粉防己堿的干預(yù)作用.pdf

1、目的:觀察人增生性瘢痕與正常皮膚組織microRNA差異表達(dá)及粉防己堿對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響，探討增生性瘢痕形成機(jī)制及粉防己堿在瘢痕防治中的意義。
　　方法:(1)收集增生性瘢痕作為實(shí)驗(yàn)組T1，其鄰近正常皮膚組織作為對照組C1，采用Trizol法分別抽提總RNA，先用mirVanaTMmicroRNA分離試劑盒對其進(jìn)行純化，然后使用microRNA標(biāo)記和雜交試劑盒進(jìn)行熒光標(biāo)記及芯片雜交，利用Featur

2、e Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進(jìn)行分析，再用GeneSpring(GX10.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化及差異分析，同時應(yīng)用實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)驗(yàn)證microRNA芯片結(jié)果的可靠性，并通過生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)明顯的microRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測。(2)取人增生性瘢痕組織標(biāo)本，體外分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，加入濃度為5μg/ml的粉防己堿干預(yù)作為實(shí)驗(yàn)組T2，并以不含藥物的人增生性瘢痕成纖

3、維細(xì)胞作為對照組C2。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，采用microRNA微陣列芯片檢測技術(shù)進(jìn)行芯片雜交，并應(yīng)用實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)驗(yàn)證microRNA芯片結(jié)果的可靠性，通過生物信息學(xué)方法對經(jīng)過驗(yàn)證的microRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測。
　　結(jié)果:(1)篩選出在人增生性瘢痕中表達(dá)上調(diào)的microRNAs92個，表達(dá)下調(diào)的microRNAs13個。其中顯著上調(diào)的有hsa-miR-564，hsa-miR-936等;

4、顯著下調(diào)的有hsa-miR-451，hsa-miR-223，hsa-miR-363，hsa-miR-29b-1*等。其中上調(diào)的hsa-miR-21和下調(diào)的hsa-miR-451的Real-Time PCR驗(yàn)證結(jié)果與檢測結(jié)果具有較好的一致性。部分microRNAs的靶基因與成纖維細(xì)胞生長、膠原形成及細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡和分化密切相關(guān)。(2)篩選出在粉防己堿干預(yù)組中表達(dá)下調(diào)的microRNAs有186個，如:hsa-miR-1246，hs

5、a-miR-10b，hsa-miR-760等;表達(dá)上調(diào)的microRNAs有7個，如:hsa-miR-27b，hsa-miR-29b-1*，hsa-miR-193a-3p等。Real-Time PCR對其中表達(dá)上調(diào)的hsa-miR-27b和表達(dá)下調(diào)的hsa-miR-125b的驗(yàn)證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果具有較好的一致性，其靶基因不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種信號通路，還與膠原形成息息相關(guān)。
　　結(jié)論:人增生性瘢痕和正常皮膚組織中存在