尾加壓素抑制單核巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的研究.pdf

1、心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是各種心臟病的嚴(yán)重階段。其發(fā)病率高，5年存活率與惡性腫瘤相仿。在美國(guó)心臟病學(xué)院2003年年會(huì)開幕式上，Braunwald教授將心衰稱作為心臟病最后的大戰(zhàn)場(chǎng)。據(jù)國(guó)外流行病學(xué)研究統(tǒng)計(jì)，人群中心衰的患病率約為1.5％～2.0％，65歲以上人群可達(dá)6％～10％。在過去的40年中，由心衰導(dǎo)致的死亡增加了6倍。專家預(yù)測(cè)近期內(nèi)心衰的發(fā)病率仍將繼續(xù)增長(zhǎng)。因此，心衰正在成為21世紀(jì)最重要的心血管病癥。心衰時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)(EC

2、M)的變化可表現(xiàn)為纖維膠原的過度沉積，或不適當(dāng)?shù)慕到狻＠绻Ｋ佬呐K的非梗死區(qū)、高血壓心臟病的肥厚左室和非肥厚右室均有間質(zhì)纖維化?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMps)是ECM代謝的主要蛋白酶，單核/巨噬細(xì)胞是合成基質(zhì)金屬蛋白酶的主要部位，后者以酶原形式分泌，被激活后可降解細(xì)胞外基質(zhì)。因而基質(zhì)金屬蛋白酶在心室重塑的調(diào)控中起著十分重要的作用，并影響心衰的發(fā)生、發(fā)展過程。針對(duì)心衰，盡管目前的治療措施很多，但仍有相當(dāng)一部分患者對(duì)現(xiàn)有藥物治療無效，研究者不斷

3、在尋找新的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)。尾加壓素Ⅱ(UrotensinⅡ)即是近期發(fā)現(xiàn)和研究熱點(diǎn)之一，它是一種由十二個(gè)氨基酸組成的具有血管活性的“生長(zhǎng)抑素樣環(huán)肽”，最早從硬骨魚尾部的神經(jīng)分泌系統(tǒng)——尾部下垂體中分離出來，后來證實(shí)從軟體動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中均有存在。U-Ⅱ?qū)Χ嘞到y(tǒng)具有復(fù)雜的生理效應(yīng)，目前研究多集中于心血管系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。1999年Ames等首次證實(shí)人體內(nèi)有Urotensin-Ⅱ的特異性受體——孤兒受體GPR14的存在，并

4、在人的心血管組織中(包括冠狀動(dòng)脈硬化的斑塊)發(fā)現(xiàn)了UrotensinⅡ的存在。心肌組織、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊以及脂質(zhì)沉淀的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞豐富的區(qū)域富含Urotensin-Ⅱ。DouglasAS等對(duì)晚期心哀患者的心肌組織尾加壓素含量及其受體含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅心肌細(xì)胞，晚期心哀患者炎癥細(xì)胞尾加壓素含量亦有升高。UⅡ與GPR14結(jié)合后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]升高，引起心功能抑制、血管收縮等一系列心血管效應(yīng)，其縮血管效應(yīng)比內(nèi)皮素-1

5、(ET-1)強(qiáng)10余倍，是迄今發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)之一，是目前已知的在哺乳動(dòng)物體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，并具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞分裂增殖的作用。上述發(fā)現(xiàn)均提示Urotensin-Ⅱ可能影響心血管的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和病理過程，可能參與了心血管疾病病理狀態(tài)下的心室重塑過程。本研究從細(xì)胞水平出發(fā)，以單核細(xì)胞為研究對(duì)象，探討Urotensin-Ⅱ與心室重塑的關(guān)系。 目的：通過觀察尾加壓素Ⅱ?qū)θ藛魏司奘杉?xì)胞增殖和功能的影響，

6、闡明這一血管活性物質(zhì)在心室重塑中的意義和可能發(fā)揮的作用；通過對(duì)尾加壓素與心室重塑關(guān)系的研究，為心血管疾病的防治提供理論和實(shí)踐依據(jù)。 方法：1.取健康人新鮮靜脈全血，用相對(duì)密度為1.076的Percoll應(yīng)用液，分離提取單核細(xì)胞層，Hanks液清洗后在37℃條件下RPMI1640液中培養(yǎng)2小時(shí)。洗去上層淋巴液，貼壁的單核細(xì)胞用RPMI+5％CO2、30％自體血清在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天。 2.分組24孔塑料培養(yǎng)板，每孔加入

7、單核巨噬細(xì)胞、濃度為2×105個(gè)/ml細(xì)胞0.5ml，隨機(jī)分組，n=6。分別加入1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L、0mol/L尾加壓素，每組再隨機(jī)分成3小組，n=2，分別加入3H-Leu，3H-TdR，3H-UR1μCi/ml。 3.DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成測(cè)定分組加樣細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后去培養(yǎng)液，Hanks液清洗，用0.25％胰酶+0.04％EDTA液將細(xì)胞全部消化，移至F49濾

8、紙上，經(jīng)淋洗、固定、脫水烘干后，置含0.03％POPO的二甲笨閃爍液中，在液體閃爍記數(shù)儀(Packark4000型)中測(cè)樣品放射性。 同樣加2×105個(gè)/ml細(xì)胞0.5ml于18孔塑料培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為3組，n=6，分別加入3H-UR、3H-TdR、3H-Leu1μCi/ml，用上述方法測(cè)細(xì)胞在無尾加壓素影響培養(yǎng)時(shí)第1d、4d、7dDNA、RNA和蛋白質(zhì)合成狀態(tài)。 4.細(xì)胞蛋白含量測(cè)定將細(xì)胞培養(yǎng)于8孔塑料培養(yǎng)板中，隨機(jī)分

9、組，n=2，培養(yǎng)至第3天分別加入1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L、0mmol/L尾加壓素，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，收集細(xì)胞。Lowery法常規(guī)測(cè)細(xì)胞蛋白含量。 5.總RNA抽提與逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)每107個(gè)單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞(HMDM)用1mlTRIZOL抽提液用一步法抽提總RNA。選購(gòu)MMP-2、MMP-9等寡核苷酸引物，人β-actin做內(nèi)參照。應(yīng)用圖像處理系統(tǒng)測(cè)定平

10、均光密度值(OPTDM)。 6.目的蛋白表達(dá)檢測(cè)采用WesternBlot方法。首先SDS-PAGE電泳分離樣品蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移緩沖液電泳200mA、100V電泳6h轉(zhuǎn)膜，記錄標(biāo)準(zhǔn)蛋白的位置，洗膜，封閉液封閉，漂洗，加含二抗的印記緩沖液雜交，再漂洗，發(fā)光底物緩沖液沖洗，顯色液顯色，暗房中感光，拍照并行灰度掃描測(cè)定。 7.MMPs活性測(cè)定采用Zymography方法。SDS-PAGE電泳，在配制12％分離膠過程中，加入一定量白

11、明膠使其濃度為1g/L。細(xì)胞上清液與載樣緩沖液以3：1比例混合后，取20μl不經(jīng)煮沸直接加在4％濃縮膠的加樣孔內(nèi)，4℃、200mA、200V電壓下電泳。電泳后將膠洗滌，孵育緩沖液內(nèi)37℃孵育過夜，CoomassieBlueR-250染色，脫色液中脫色，照相，對(duì)降解帶密度、面積進(jìn)行掃描測(cè)定，干膠保留。每次電泳均同時(shí)加同一對(duì)照細(xì)胞上清液標(biāo)本作為內(nèi)參照，以降解條帶密度面積的乘積表示MMPs活性。 結(jié)果：1.在RPMI1640+5％CO

12、2、30％自體血清中，細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟、分裂狀態(tài)良好，細(xì)胞合成DNA、RNA、蛋白迅速，尤以3H-UR摻入作用較強(qiáng)。 成熟的人單核巨噬細(xì)胞與1×10-8mmol/L、1×10-9mmol/L、1×10-10mmol/L、0mmol/L濃度范圍的尾加壓素孵育24h，未見細(xì)胞有形態(tài)學(xué)改變。1×10-10mmol/L尾加壓素即對(duì)3H-UR，3H-TdR摻入有抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)。隨濃度升高，對(duì)兩者作用均加強(qiáng)，且在1×1

13、0-9mmol/L、1×10-8mmol/L濃度處對(duì)3H-TdR摻入抑制作用較3H-UR強(qiáng)，對(duì)RNA與DNA合成抑制作用兩者比較差異有顯著性。在該濃度范圍內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)合成抑制作用較弱，低濃度時(shí)(1×10-10mmol/L)無抑制作用，在1×10-8mmol/L、1×10-9mol/L濃度時(shí)有抑制作用(p＜0.05)，其作用低于DNA、RNA組，兩者比較均有顯著性(p＜0.05)。 2.細(xì)胞與尾加壓素培養(yǎng)4d后，尾加壓素組細(xì)胞透亮度

14、較高，形態(tài)不及對(duì)照組飽滿，顆粒較少，蛋白質(zhì)含量差異明顯(p＜0.01)，細(xì)胞活力純度無影響，作用呈濃度依賴性。 3.UrotensinⅡ?qū)魏思?xì)胞源巨噬細(xì)胞MMMP-2和MMP-9mRNA和蛋白表達(dá)的影響不同濃度(1×10-8、1×10-9及1×10-10mmol/L)UrotensinⅡ?qū)MDMMMP-2mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較有顯著性差異(平均光密度比值分別為0.85±0.05、0.86±0.06和0.89±0.04

15、vs0.99±0.05，n=4，P＜0.05)；MMP-9mRNA的表達(dá)也明顯低于對(duì)照組(平均光密度比值分別為0.84±0.05、0.85±0.04和0.88±0.04vs0.99±0.05，n=4，P＜0.05)。Westernblot蛋白印跡結(jié)果也表明，不同濃度UrotensinⅡ(1×10-8、1×10-9及1×10-10mmol/L)組HMDMMMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組。 4.UrotensinⅡ?qū)M

16、DMMMP-2和MMP-9活性的影響不同濃度(1×10-8、1×10-9及1×10-10mmol/L)UrotensinⅡ?qū)MDM培養(yǎng)上清MMP-2活性的影響與對(duì)照組比較有顯著性差異(平均光密度比值分別為98.35±11.15、102.29±10.45和108.45±11.25vs127.93±13.61，n=4，P＜0.05)；MMP-9的活性也明顯底于對(duì)照組(平均光密度比值分別為40.01±8.96、45.38±9.32和52.1